芪丑湯對腎間質纖維化大鼠EMT抵抗作用研究

張 翠，張 蘭，劉 穎，王曉泊，王 萌，代百東

(哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076)

腎小管間質纖維化(Tubulointerstitial fibrosis)是各種炎癥和非炎癥腎臟疾病進展的最終結局.近年來，各國學者在實驗動物模型和人類慢性腎小球疾病中發現肌成纖維細胞與腎間質纖維化的形成和發展關系密切，其標志蛋白α－平滑肌肌動蛋白(α－smooth muscleactin，α－SMA).肌成纖維細胞可分泌細胞外基質:實驗動物和人類腎小球疾病研究中證實，肌成纖維細胞可分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白等［1］，腎間質 α－SMA表達程度與Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白表達之間存在正相關.

腎小管上皮細胞向間充質細胞的轉分化作用致纖維化細胞因子過度表達、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成－降解失衡及大量積聚等因素在腎間質纖維化的發生、發展過程中起著重要作用.芪丑湯為自擬方，在對腎大部切除大鼠致慢性腎衰模型的研究中發現它可減輕腎小球硬化和腎間質纖維化的程度［1］，本研究目的旨在從分子水平探討芪丑湯對腎間質纖維化大鼠生物學效應的調控機制.

1 實驗材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠，體重(190±20)g，由黑龍江省腫瘤醫院實驗動物研究所提供，動物合格證號為:黑動字第06－4－21號.

1.2 藥物組成

黃芪50 g，大黃10 g，石菖蒲15 g，牽牛子20 g，附子10g，人參15 g，白術15 g，丹參20 g，王不留行15 g，橘皮10 g組成，以上藥物均購自哈爾濱寶豐藥業有限公司.

1.3 藥液制備

按照各藥在方中的比例準確稱取，混勻，過濾，制備芪丑湯水煎液的濃縮液，質量濃度為每毫升濃縮液含芪丑湯 1.33 g 生藥［2－3］(由哈爾濱商業大學藥學院制劑教研室制備)，4℃冰箱保存備用.

1.4 對照藥

依那普利，揚子江藥業有限公司生產，批號:05091202，國藥準字:H32026567.

1.5 試劑

小鼠抗大鼠α－平滑肌肌動蛋白(α－SMA)單克隆抗體，批號:BM0002.兔抗大鼠膠原蛋白Ⅲ(ColⅢ)多克隆抗體，批號:BA0326.第二抗體為生物素標記的馬抗小鼠IgG抗體及山羊抗兔IgG抗體，二乙酯焦碳酸(DEPC)，均由博士德生物工程有限公司提供.二氨基聯苯胺DAB顯色劑，北京中山生物技術公司提供.肌酐測定試劑盒，批號:060321;尿素測定試劑盒，批號:060151;總膽固醇測定試劑盒，批號:060211;甘油三酯試劑盒，批號:060721.均由北京中生生物工程高技術公司提供.

1.6 儀器

醫學病理圖象分析系統:HJPIAS－1000，哈爾濱醫科大學提供.病理組織漂烘儀:PHY－III，常州中威電子儀器廠提供.電熱鼓風干燥箱:DGX－9143P－1，上海福瑪實驗設備有限公司.生物組織包埋機:BM－VⅡ，孝感市宏業醫用儀器有限公司.全自動生化分析儀:LISA 300 plus型，法國生產.

血液細胞分析儀:XF9030B型，南京普朗設備有限公司.

2 實驗方法

2.1 模型制作

模型制作參見薛痕等報道［4］，采用單側輸尿管結扎方法.取雄性Wistar大鼠48只，體重(190±20)g，用10%水合氯醛35mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉后局部剪毛.選擇腹正中線切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將左側輸尿管用止血鉗托起中段部位，夾住，在止血鉗兩側用4－0號絲線兩次結扎左側輸尿管近腎盂段，兩結扎點之間剪斷輸尿管，逐層縫合皮下組織及皮膚.假手術組切開皮膚至腹腔，分離左側輸尿管但不結扎及剪斷輸尿管.手術后各鼠均腹腔注射青霉素72萬單位/kg，連續3 d以防感染.

2.2 分組與給藥

術后將大鼠隨機分為以下6組，假手術組和模型組各7只，給予等體積生理鹽水;依那普利組9只，給藥劑量為0.77 g/(kg·d－1);芪丑湯高劑量組8只，給藥劑量為26.6 g/(kg·d－1);芪丑湯中劑量組9只，給藥劑量為13.3g/(kg·d－1);芪丑湯低劑量組8只，給藥劑量為6.65g/(kg·d－1).各組灌胃給藥，每日服藥1次，連續12 d.

2.3 檢測方法

2.3.1 對腎組織病理形態的影響

腎組織縱切4%多聚甲醛固定(含有1/1000DEPC)常規脫水、浸蠟 、包埋切成2 μm的切片，片行蘇木素(Hematoxylin)—伊紅(Eosin)染色法.雙盲法于光鏡200倍下分別于左上、左下、右上、右下、中間各取2個視野，每張切片共10個視野，進行半定量分析，依據文獻［5］結合本模型特點，選取間質纖維化、小管萎縮、間質浸潤、紅細胞管型、蛋白管型、間質水腫、小管擴張、小管細胞空泡變性8項指標來判斷腎間質病理改變，每個參數按0～3分評定(0=正常，1=輕度受損，2=中度受損，3=重度受損).

2.3.2 VG 染色

常規脫蠟水洗，采用Weigert氏鐵蘇木精染核5～15min，自來水充分沖洗，鏡檢核著色程度，蒸餾水洗后以VG染液染l～5min，最長不超過7min.直接用新鮮的95%酒精急速分化兼脫水，需數秒鐘，無水酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固.膠原纖維呈深粉紅色.采用彩色病理圖像分析系統進行分析，每組隨機選取10個視野，通過深粉紅色調節區分視野內陽性信號面積，計算陽性目標面積與統計場總面積比值，取均值進行統計分析.

2.3.3 血清 Scr、BUN、CHO、TG 檢測 采用全自動生化分析儀測定.

2.3.4 紅細胞(RBC)，血紅蛋白(Hb)檢測

采用電阻抗法和光電比色法測量紅細胞和血紅蛋白的含量.

2.3.5 α－SMA、ColⅢ測定

采用免疫組化SP法檢測:腎組織石蠟切片脫蠟至水，二甲苯三次10min 1次，100%，90%，80%乙醇10min 1次.滴加蒸餾水新鮮配置的0.3%H2O2，溶液封閉內源性過氧化物酶10min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗(每次5min，共3次)，在微波緩沖液中微波修復10min.滴加非免疫性驢血清封閉液(含10%驢血清)，室溫下10min.滴加工作質量濃度的第一抗體(小鼠抗大鼠α－SMA單克隆抗體，兔抗大鼠LN多克隆抗體，兔抗大鼠ColⅢ多克隆抗體)4℃過夜.0.1 mol PBS液洗3次;每次3min.加入二抗(生物素標記的抗小鼠IgG抗體及抗兔IgG抗體)37℃孵育30min，0.1 mol PBS液洗3次，每次3min.滴加鏈霉卵白素－堿磷酶軛合物37℃孵育40min，用DAB顯色液顯色3～5min，蘇木素復染3min，切片經梯度脫水干燥、二甲苯透明、用樹脂封片.每組均以PBS代替第一抗體作陰性對照.實驗結果采用單盲法評價.借助HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統，每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，測定腎間質陽性面積和小管間質總面積的比值，進行免疫組化半定量分析后取均值.

2.4 統計分析

3 實驗結果

3.1 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織病理形態的影響

術后12d模型組左側腎臟體積較對側明顯增大，鏡下見皮髓質明顯變薄，以髓質為重，可見腎小管排列紊亂，彌漫的腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性，部分腎小管腔內有蛋白或細胞管型、多數腎小管擴張、灶狀萎縮，偶見壞死，腎間質增寬，有散在或多灶狀單核、淋巴細胞浸潤和間質纖維化，腎小球改變不明顯.假手術組腎間質損傷指數為(0.83±0.23)，模型組(10.71 ±1.13)，依那普利組(8.51 ±1.06)，高劑量組(6.62 ±1.54)，中劑量組(4.93±0.97)，低劑量組(5.85 ±2.03)，模型組與假手術組比較，病理變化有顯著性差異(P＜0.01)，表明單側輸尿管梗阻后大鼠腎組織呈現腎間質纖維化樣改變.各治療組與模型組相比，均可使病理變化降低(P＜0.05)，芪丑湯中劑量組與依那普利組比較具有明顯的差異性(P＜0.05)，表明芪丑湯具有減輕腎小管上皮細胞壞死，間質炎癥細胞浸潤，減輕腎間質纖維化作用.

3.2 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織VG染色與膠原分布的影響

采用彩色病理圖像分析系統，計算陽性目標面積與統計場總面積比值.假手術組陽性信號面積為(4.33 ±1.33)，模型組(33.81 ±6.13)，依那普利組(23.51 ±2.91)，高劑量組(18.77 ±2.24)，中劑量組(15.93 ±2.57)，低劑量組(24.25 ±3.03).模型組與假手術組比較，陽性信號面積比有顯著性差異(P＜0.01)，表明單側輸尿管梗阻后大鼠腎組織膠原分布含量升高.各治療組與模型組比較，均可使陽性信號面積比明顯降低(P＜0.05)，芪丑湯中劑量組與依那普利組比較具有明顯的差異性(P＜0.05).

3.3 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)的影響

圖1、2結果表明:模型組與假手術組比較差異非常顯著(P＜0.01)，說明大鼠單側輸尿管梗阻后可使BUN、Scr明顯升高;各給藥組同模型對照組相比，均可使 BUN、Scr明顯降低(P ＜0.05).芪丑湯中劑量組同依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

圖1 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清Scr的影響)

圖2 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清BUN的影響()

3.4 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)的影響

圖3、4結果表明:模型組與假手術組比較血清CHO、TG明顯升高(P＜0.01);各給藥組與模型對照組相比均可使CHO、TG明顯降低(P＜0.01).芪丑湯中劑量組與依那普利組比較有的差異性(P＜0.05).

圖3 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清CHO影響()

圖4 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠血清TG的影響()

3.5 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠RBC、Hb的影響

從圖5、6結果看出:模型組與假手術組比較，RBC、Hb明顯降低(P＜0.01)，表明大鼠單側輸尿管梗阻后可使RBC、Hb濃度降低.各治療組與模型組比較，可使 RBC、Hb明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);中劑量組與依那普利組比較，RBC、Hb有明顯的差異性(P＜0.05);表明芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠引起的RBC、Hb濃度降低具有明顯的升高作用，并且作用強度強于依那普利陽性組，且以中劑量作用為最佳(P＜0.05).

3.6 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、ColⅢ表達的影響

圖5 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠RBC的影響()

圖6 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠Hb的影響()

表1結果表明:模型組與假手術組比較，大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ的表達有顯著性差異(P＜0.01);各給藥組與模型組比較，均可使α－SMA、ColⅢ的表達明顯降低(P＜0.01).芪丑湯中劑量組與依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

表1 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ表達的影響()

表1 芪丑湯對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ表達的影響()

4 討論

近來國外的研究表明:腎小管上皮細胞－肌纖維母細胞表型轉化，在人類腎間質纖維化相關的腎臟疾病和動物模型中扮演了重要角色.α平滑肌肌動蛋白(α－ smooth muscular actin，α－SMA)，已被公認為肌纖維母細胞的標志蛋白，用免疫組織化學的方法觀察到，在正常腎組織，α－SMA只在腎臟血管中層表達，而在腎小球和腎間質中幾乎無表達.在腎臟病理條件下，α－SMA可在腎小球系膜區、腎小球周圍間質、萎縮的小管周圍纖維化區域及血管周圍表達并增生，參與腎臟纖維化形成［6－7］.本實驗結果顯示，在單側輸尿管梗阻大鼠術后第12天腎間質區域可見大量的α－SMA強陽性表達細胞，提示腎間質纖維化后已有大量的腎小管上皮細胞轉化為肌纖維母細胞，且在α－SMA表達增強的同時伴有Ⅲ型膠原蛋白的高度表達.

腎小管間質纖維化它以過量細胞外基質(如膠原Ⅲ型)在腎間質積聚及腎間質成纖維細胞增生為特征.本研究采用VG膠原染色可以清晰的觀察到間質內膠原隨著病變的加重其沉積逐漸增多.膠原纖維呈束狀或灶狀增生，深粉紅色.經芪丑湯治療后間質內膠原沉積逐漸減少，陽性信號面積比明顯降低，顏色變淺，與依那普利組比較具有明顯的差異性(P ＜0.05).

尿素的長期毒性作用與其代謝產物氰酸鹽有關，它可使蛋白質發生氨基甲酰化，如在觸突體膜蛋白發生這一變化時，高級神經中樞的整合功能可受到損害.肌酐是肌肉內磷酸肌酸的代謝產物，有人報告肌酐具有溶血、抑制組織對葡萄糖和氧的攝取、抑制紅細胞增殖與成熟等作用.本實驗結果表明(見表1)，芪丑湯可明顯改善RIF大鼠腎功能，加速BuN、Scr等有毒物質排出，延緩RIF發展趨勢.芪丑湯中劑量組同陽性藥依那普利組比較，BUN、Scr具有明顯的差異性(P＜0.05);表明芪丑湯對大鼠單側輸尿管梗阻后引起的BUN、Scr升高具有明顯的降低作用，并且作用強度強于依那普利陽性藥.方中大黃能改善氮質代謝，這是因為大黃能減少腸道對氨基酸(合成尿素的原料)的吸收，增加谷氨酰酶合成酶活性，促進氨合成氨酰胺和蛋白質，并且抑制肝、腎組織合成尿素，抑制蛋白質分解，減少尿素和肌酐的生成，促進尿素和肌酐從腎臟排出［8］.藥理研究表明:黃芪、人參、附子、丹參、水蛭均可降 BuN、Scr［9］.

近年研究表明，血膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、氧化型低密度脂蛋白(Ox－LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)及其中間代謝產物與腎間質炎癥及纖維化的進展密切相關，且皮質中膽固醇的含量與腎小管間質損傷的嚴重性呈正相關［10］本實驗結果表明，芪丑湯對腎間質纖維化大鼠所引起的CHO、TG升高具有降低作用，與陽性藥依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

現代醫學認為，腎性貧血的發病機理主要是由于腎臟產生促紅細胞生成素(EPO)減少，還與營養性貧血、慢性失血性貧血以及體內毒素對骨髓造血的抑制有關.近有學者報道紅細胞膜結構和功能的改變，也是腎性貧血的機制之一，改善造血微環境、恢復紅細胞膜的正常和功能利于其病的治療［11］.本實驗研究結果表明:各治療組與模型組比較，可使RBC、Hb明顯升高(P＜0.01);中劑量組與依那普利組比較，RBC、Hb有明顯的差異性(P＜0.05).方中黃芪、人參、茯苓、白術健運脾胃以培后天之本;大黃通腑泄濁;半夏化濁降逆;砂仁理氣和胃;丹參行氣活血，共奏補脾益腎，益氣生血之功.現代藥理研究:黃芪能促進紅細胞和血紅蛋白增加［12］.

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