地塞米松對大鼠腦出血后周圍腦組織MMP-9表達的影響

王善軍,王道奎,王玉亭,閆瑞云

基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一組降解細胞外基質(ECM)分子的鋅、鈣依賴性的中性蛋白酶類,在神經系統中MMP-9最為重要,Gursoy-Ozdemir等[1]發現血漿蛋白的滲漏與腦水腫形成同時發生,而在沒有MMP-9的老鼠中沒有發現蛋白質滲漏,由此推測大鼠ICH腦水腫的形成可能與MMP-9的形成及ECM的降解有關。DEX作為臨床上常用的控制腦水腫的輔助用藥,其療效已為大多數醫生所接受,然而其對物質代謝、神經細胞凋亡等諸多方面的負面影響又不容忽視,本實驗通過從DEX與MMP-9表達的影響方面入手,研究DEX對控制腦水腫的可能的作用通道,從而為副作用小、效果更好的DEX替代藥物的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Wistar大鼠,由濰坊醫學院動物房代購于山東魯抗醫藥股份有限公司(許可證號：scxk魯20080002),體重 310～380 g,隨機分為A、B、C 3組;大鼠腦立體定向儀(ZH-藍星B型)、100μl微量注射器、手術器械包、MMP-9-抗(北京中杉)、PV 9003試劑盒(北京中杉)、DAB試劑盒等。

1.2 方法 (1)分組：63只雄性Wistar大鼠,隨機分為A組(DEX干預組)21只;B組(模型組)21只;C組(對照組)21只,分別按照時間點6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d、14 d分為7個亞組,每組 3只。(2)建立大鼠腦出血模型：參照Xue等[1]方法,以前囟前0.2mm,中線右旁開3mm,垂直進針5.5mm,為大鼠右側基底節區;斷尾取血 50μl,以微量注射器緩慢注入腦內定位的位置。(3)取材、包埋、切片分別于各時間點大鼠經水合氯醛麻醉后,以頸總動脈灌注固定,4%多聚甲醛固定 24～48 h后制成蠟塊,切片后 60℃烤箱 1～2h后備用。

1.3 MMP-9檢測 按照說明書對MMP-9采用PV 9003試劑盒進行檢測,DAB顯色,陽性細胞呈棕黃色,每張切片在高倍鏡(×400)下選取 3個不同視野,記錄每個視野陽性細胞數,取平均值作為陽性細胞計數。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。數據均以±s表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)做統計學檢驗,P＜0.05視為有統計學意義。

2 結果

MMP-9主要分布于神經元及膠質細胞的細胞膜及胞漿中,胞膜及胞漿被染成棕褐色。對照組：血腫周圍腦組織僅見少量MMP-9陽性細胞;模型組：6h可見少量的散在的陽性細胞表達,24 h陽性細胞開始明顯增多,第 3天達到高峰,到第14天時仍有少量表達;DEX干預組：6 h可見較少陽性細胞表達,同樣在24h開始迅速增多,第 3天達到高峰,后逐漸下降, 14 d時仍可見少量的MMP-9陽性細胞。DEX干預組、模型組、對照組之間兩兩比較差別均有統計學意義(P＜0.05)。DEX干預組12 h、24h、3 d、5 d、7 d時間點MMP-9陽性細胞計數與模型組相比差異有統計學意義(P＜0.05),6 h、14 d時DEX干預組與模型組相比差別無統計學意義(P＞0.05),見表 1;3組各時間點具體陽性細胞數見表 2。

表1 各組在各時間點之間兩兩比較的P值

表2 各組各時間點MMP-9陽性細胞數(±s)

表2 各組各時間點MMP-9陽性細胞數(±s)

組別 例數 6h 12h 24h 3d 5d 7d 14d DEX干預組 21 2.815±2.734 13.259±7.547 19.778±6.265 36.037±8.682 23.000±7.063 12.037±7.109 3.259±2.510模型組 21 6.408±5.328 28.296±4.920 36.963±6.330 65.333±13.314 48.444±7.409 26.333±11.371 2.555±2.075對照組 21 1.593±1.690 2.037±1.111 1.778±1.364 2.704±1.911 1.852±1.375 1.148±1.056 1.481±1.144

3 討論

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是臨床常見病,作為預后最差的卒中類型[2-3]在我國發病比例遠高于歐美,約占全部腦卒中的 30%[4],其發病率、致殘率和病死率均較高。腦水腫是ICH后最重要并發癥之一,其產生和發展是導致ICH患者病情惡化或死亡的主要原因之一,臨床上能否有效控制腦水腫成為治療腦出血成功與否的重要指標,對腦出血患者的病程及療效產生深遠的影響。故深入研究腦出血后水腫的形成機制并結合相應機制通道給予積極、有效的治療,降低其致殘率、病死率成為目前臨床治療腦出血需要迫切解決的問題。近年來在腦出血后腦水腫形成機制方面的研究取得了一定的成果。研究發現,腦出血后水腫是細胞毒性水腫和血管源性水腫的共同結果,其作用機制包括,液體靜力壓和血凝塊回縮、凝血酶原的產生和激活、血紅蛋白的毒性作用、補體激活、炎性反應損傷和血腦屏障開放等。其中血腦屏障(b loodbrain barrier,BBB)破壞對繼發腦水腫形成的作用,受到越來越多的重視。

血腦屏障(BBB)主要由腦毛細血管內皮細胞、血管基底膜以及膠質細胞足突構成。細胞外基質(extracellar matrix, ECM)分子如Ⅳ型膠原、層粘蛋白和纖維連接蛋白等構成的基膜是維持BBB完整的重要結構基礎,直接決定著BBB的通透性,如果其遭受破壞,將使血管通透性增加,導致血管源性腦水腫。

地塞米松作為重要的控制腦水腫的輔助用藥,藥理作用廣泛,具有抗炎、抗免疫、抗毒素、抗休克作用,廣泛應用于臨床,控制腦水腫的作用被大多數研究人員所認同,已有學者[5]認為其作用機制是通過減少炎癥因子的生成,從而減輕血腦屏障的破壞來減輕腦水腫的 ,具體的作用通道及機理各研究卻不統一,Hyongbum Kim等[6]認為地塞米松是通過調節血管生成素 1和血管內皮生長因子來實現的,而 GU YT等[7]認為是通過減少AQP-4的表達實現的,近年來MMP-9在血腦屏障破壞及繼發性腦水腫方面的研究日益受到重視。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解細胞外基質(ECM)分子的鋅、鈣依賴性的中性蛋白酶類,在神經系統中MMP-9最為重要,Rosenberg等[8]在細菌膠原酶誘導的大鼠ICH模型上發現,模型大鼠24 h腦組織含水量和MMP-9含量增加,并伴有富含Ⅳ型膠原的腦血管床基膜的破壞,MMPs抑制劑(tissue inhibitor ofmetalloproteinase,TIMPs)能顯著降低細菌膠原酶注射部位周圍腦組織的含水量。Gursoy-Ozdemir等[9]發現血漿蛋白的滲漏與腦水腫形成同時發生,而在沒有MMP-9的老鼠中沒有發現蛋白質滲漏,由此推測大鼠 ICH腦水腫的形成可能與MMP-9的形成及ECM的降解、BBB基底膜的破壞有關。目前國內外研究多集中在 MMP-9與血腦屏障破壞及腦水腫的關系上,藥物干預對MMP-9在腦出血時周圍腦組織中表達的影響的研究較少。

本實驗DEX干預組與模型組之間在12h、24h、3 d、5 d、7 d時間點MMP-9陽性表達的差別有統計學意義(P＜0.05),說明DEX對MMP-9的表達有影響,能夠減少MMP-9的表達,這與DEX減輕腦水腫的作用過程相一致,因此我們認為DEX減輕腦水腫與MMP-9作用通道有關。14 d時3組之間差別均無統計學意義(P＞0.05),說明DEX對MMP-9表達的影響主要集中在7 d以內。因此我們認為,從MMP-9作用通道來看, DEX用于控制水腫為目的時,應該控制在發病后 7 d內,發病7 d以后,特別是 14 d以后應用已無臨床意義。

綜上所述,我們推測 DEX減輕腦水腫是通過減輕血管源性腦水腫和細胞中毒性腦水腫兩個方面實現的,可能的作用機理為：(1)特異性抑制生物活性物質(如MMP-9等)的生成,從而減少細胞外基質的溶解、破壞,從而降低血腦屏障的通透性;(2)非特異性抗炎作用,通過阻斷炎癥級聯,減少炎癥因子的生成及活化,減輕細胞的炎癥反應,從而減輕腦出血后繼發性損傷;(3)增加細胞間連接的緊張度,從而減輕細胞間隙內水分的聚集;(4)穩定細胞膜的離子通道,增強鈉-鉀泵等在維持細胞內外離子分布中的作用;具體的作用機制及其他主要的作用靶點有待于進一步地研究。

[1] Gursoy-Ozdem ir Y,Qiu J,Matsuoka N,et al.Cortical spreading de-pression activates and upregulates MMP-9[J].Clin Invest,2004,113 (10)：1447-1455.

[2] Silva Y,Leira R,Tejada J,et al.Molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage [J].Stroke,2005,36(1)：86-91.

[3] Mayer SA.Ultra-early hemostatic therapy for intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2003,34(1)：224-229.

[4] Brown DL,Morgenstern LB.Stopping the bleeding in intracerebral hemorrhage[J].N Engl JMed,2005,352(8)：828-830.

[5] Sugimura Y,Murase T,Takefuji S,et al.Protective effect of dexamethasone on osmotic-induced demyelinationin rats[J].Exp Neurol, 2005,192(1)：178–183.

[6] Kim H,Lee JM,Park JS,et al.Dexamethasone coordinately regulates angiopoietin-1 and VEGF：A mechanism of glucocorticoid-induced stabilization of blood-brain barrier[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,372(1)：243–248.

[7] Gu YT,Zhang H,Xue YX.Dexamethasone treatment modulates aquaporin-4 expression after intracerebral hemorrhage in rats[J]. Neurosci Lett,2007,413(2)：126-131.

[8] Rosenberg GA,Navratil M.Metalloproteinase inhibition blocks edema in intracerebral hemorrhage in the rat[J].Neurology,1997,48 (4)：921-926.