氯化和UVC滅活銅綠微囊藻的機理*

歐樺瑟 高乃云 郭建偉 梅紅 李甜 董磊

(1.同濟大學環境科學與工程學院∥污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200092; 2.上海大學環境與化學工程學院，上海200444)

近年來水體富營養化問題日益嚴重，江河湖泊以及近海均有水華爆發并對人類的正常生活、生產建設和社會活動產生了重大影響，甚至造成了巨大的經濟和社會損失，因而引起了人們的廣泛關注［1-2］.銅綠微囊藻作為常見淡水藻，是我國滇池和太湖等湖泊的主要危害型藻種，其過量繁殖會產生多種危害，包括產生劇毒微囊藻毒素(MCs)和嗅味物質，同時藻細胞分泌物和殘體形成藻源溶解性有機物(AOM)，它是天然有機物(NOM)的重要組成，其中含有多種消毒副產物(DBPs)的前體物［3］，會對飲用水安全構成重大威脅.

采用熒光光譜技術研究NOM是近年來的研究熱點.熒光光譜技術具有選擇性好，靈敏度高(10－9數量級)，且不破壞樣品結構的優點，適用于研究生化水質樣品的化學和物理性質［4］.目前常用的熒光光譜技術有熒光激發光譜、熒光發射光譜、同步熒光光譜以及熒光光譜矩陣(EEM).EEM已被廣泛用于海洋和環境方面的水質調查和檢測中，國內外學者和研究人員用其對腐殖質、蛋白質、氨基酸等溶解性有機物(DOM)成分進行了研究［5］，同時將其應用在膜處理方面;近年來亦有研究人員在含藻水的水質跟蹤調查中采用EEM.藻類屬于微生物，對藻類的研究還需結合一定的生化指標和檢測技術.本研究采用EEM技術，結合常見生化指標，包括總蛋白含量、藻藍蛋白含量、葉綠素a含量、藻毒素(MC-LR)含量以及溶解性有機碳(DOC)含量(均指質量濃度)，對氯化(即投加NaClO)和短波紫外線照射(UVC)的滅活銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)過程進行對比，深入探討其反應機理，以期為實際除藻過程中的水質檢測和生化分析提供有效的指導和理論參考.

1 材料和方法

1.1 藻種的培養

銅綠微囊藻藻種(Microcystis aeruginosa，FACHB-912)購自中國科學院武漢水生生物研究所，采用BG11培養基進行培養.銅綠微囊藻母液在恒溫培養箱中于(25±1)℃下進行培養，培養箱內光照度為1500 lx，光暗周期為12h∶12h.試驗時，取一定量處于對數期的藻母液用滅菌BG11培養基稀釋到所需濃度，從而得到實驗用液.

1.2 實驗試劑

采用36.5%的NaClO溶液(分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產)，于實驗前30 min配制并使用便攜式檢測儀按照國標方法進行質量濃度檢測.用KH2PO4-NaOH緩沖溶液對反應溶液的pH值進行調節.試驗用水均采用Milli-Q超純水，純水機由美國Millipore公司生產.

1.3 實驗方法

采用同一培養階段的銅綠微囊藻進行反應，實驗前用顯微鏡鏡檢測定單位體積內藻細胞個數并調節pH值到6.8，以藻密度為4.6×107個/mL的藻懸濁液進行反應.分別采用氯化和UVC照射兩種方法對其進行處理，其中，UVC單位照射劑量為23W/m2UVC照射裝置如圖1所示.NaClO溶液初始質量濃度為3mg/L(以Cl2計).在特定時間取樣(取樣容器中預加Na2SO3溶液，用于終止反應)，取樣后立即離心10min(5000 r/min)，上清液用GF/F濾紙(由英國Whatman公司生產)過濾，得含有胞外溶解性有機物(EDOM)的溶液;過濾后將濾紙搗碎，與離心管沉積物混合并用超純水定容;采用連續凍融法(重復3次)，通過鏡檢確保藻細胞破裂達到90%以上，然后用GF/F濾紙過濾，即得胞內溶解性有機物(IDOM)溶液.

圖1 準平行UVC照射裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of collimated UVC irradiation device

1.4 分析方法

EEM采用日本Hitachi公司生產的 F-4500型熒光光譜分析儀進行測定.激發光源為150 W的氙弧燈，光電倍增管(PMT)電壓為700 V;激發帶通為5 nm，發射帶通為 10 nm;激發波長λex=215～450nm，發射波長λem=280～550 nm;掃描速度為1200nm/min;掃描光譜進行儀器自動校正.使用Matlab軟件進行EEM數據處理.采用e2695-2489高效液相色譜系統(美國Waters公司)，配合島津公司的VP-ODS色譜柱(250.0 mm×4.6 mm)測定MC-LR含量;流動相為體積比為6∶4的甲醇/超純水混合溶液，其中甲醇為HPLC純，德國Merck公司生產，超純水中預先添加0.05%(體積分數)的三氟乙酸;流動相流速為1mL/min，柱溫為40℃.

DOC含量采用TOC-VCPH分析儀(日本Shimazu公司)進行檢測;總蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定;藻藍蛋白含量采用OTSUKI所述方法進行檢測［6］;葉綠素a含量采用文獻［7］中所述方法進行提取和檢測;pH值采用PHS-3C型pH計測定.

2 結果和討論

2.1 銅綠微囊藻的常規參數和EEM特性

對數生長期的銅綠微囊藻的各項水質和生命指標見表1.圖2(a)和2(b)分別為對數生長期銅綠微囊藻的胞外和胞內溶解性有機物的EEM特征.

表1 銅綠微囊藻的特征參數Table 1 Characteristic parameters of Microcystis aeruginosa

圖2 對數生長期銅綠微囊藻的EDOM與IDOM的EEM特征Fig.2 EEM properties of extracellular and intracellular dissolved organic matters of Microcystis aeruginosa in logarithmic growing period

由圖2中可知:EDOM只有一個比較明顯的熒光峰(峰A，位于λex=280 nm、λem=331 nm處)，屬于類蛋白質物質的峰;在λex＞250 nm，λem＞350 nm的區域內有一片強度低、寬闊的峰帶(峰C和D)，屬于類腐殖質物質的峰.位于峰A的熒光有機物主要為微生物溶解性有機物，可能是由一些帶有熒光基團(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的氨基酸、多肽和蛋白質所組成的;根據文獻［8］，峰C和D所代表的物質是由藻體分泌物以及死亡藻類細胞殘留物所構成的，包括類富里酸和類腐殖酸等，成分復雜;較低的響應值說明處于對數生長期的藻類懸濁液中，藻類活性高，細菌數量少且細菌降解活動不明顯.

與EDOM不同，IDOM具有4個較明顯的熒光峰，分別是兩個類蛋白質物質的峰A和B(峰A位于λex=280 nm、λem=331 nm處，峰 B位于λex= 230nm、λem=330 nm處)以及兩個類腐殖質物質的峰C和D(峰C位于λex=273nm、λem=450nm處，峰D位于λex=354 nm、λem=447 nm處).其中，峰A和B面積廣，強度大，對應于多種熒光物質，微生物產生的溶解性有機物、芳香族蛋白質以及酚類物質在峰A位置均有響應［5］，而類酪氨酸和類色氨酸芳香族物質在峰B位置有響應.峰A和B表征了正常的藍藻細胞中所含的多種熒光物質，主要有:蛋白質(酶、藻藍蛋白)、多肽(藻毒素)、氨基酸、DNA以及葉綠素a(葉綠素a屬于疏水物質，提取的IDOM中含量極少).峰C和D主要為類富里酸和類腐殖酸物質的峰，它們可能來源于死亡的藻細胞.

2.2 氯化和UVC處理銅綠微囊藻的機理分析

2.2.1 UVC反應過程中的多參數特性分析

UVC屬于短波紫外光，190～280 nm波長范圍的紫外光都屬于UVC，本實驗采用波長為254nm的紫外光照射滅藻.UVC照射引起的胞內外溶解性有機物的EEM特征變化見圖3，每個EEM譜圖反映了該時間點的熒光物質特性.圖4為UVC反應過程中EEM各個特征峰的峰值(FI)變化，其中t表示時間.由圖3、4可知，EDOM的主要特征峰為峰A、C和D，其中，峰A的熒光強度隨著時間延長逐漸減弱，而峰C和D的則先增強后減弱;FI可以提供定量分析，原樣的峰A的FI為142 AU，反應20 min后減少為53 AU，60 min后基本檢測不出;原樣的峰C和D的FI在20～40 min產生突躍，FI分別從33 AU和23 AU增加到200 AU和140 AU，之后又有所降低.IDOM的EEM譜圖則包括4個峰:峰A、B、C和D，其中，峰A和B的響應值在0～60 min均降低，FI分別從545 AU和293 AU逐漸降低到30 AU和20 AU;而峰C和D的FI則隨時間的延長先增后減，曲線拐點出現在20 min時，和EDOM的峰C和D的FI突躍過程同步.

圖3 UVC反應過程中銅綠微囊藻的EDOM和IDOM的EEM特征變化Fig.3 EEM properties of extracellular and intracellular dissolved organic matters of Microcystis aeruginosa under UVC treatment

圖4 UVC反應過程中EDOM和IDOM的FI變化Fig.4 Variation of FI of extracellular and intracellular dissolved organic matters under UVC treatment

UVC照射引起的銅綠微囊藻的生化指標和DOC含量的變化見表2.四種物質對UVC具有不同的耐受性，降解速度為:MC-LR＞藻藍蛋白＞總蛋白＞葉綠素a.DOC含量的變化則具有一定的互補性，但總和并非恒定值，即UVC降解過程中有一定的礦化作用.

表2 UVC反應過程中生化指標和DOC含量的變化Table 2 Variations of biochemical parameters and DOC content under UVC treatment

EEM、生化指標以及DOC含量的變化對解釋UVC的滅藻機理具有重要意義.在本實驗中，UVC主要通過光降解和高級氧化進行滅藻.UVC具有強透射性，高強度UVC能引發細胞內蛋白質、多肽、氨基酸等的光降解;同時，UVC能在細胞內和細胞外同時引發強氧化性物質的生成，如OH·、H2O2等，對藻細胞具有強烈的刺激和氧化作用.

反應前期(0～30 min)，藻細胞在UV照射下仍保持完整的細胞形態，但此時其胞內外生命物質已開始降解.最明顯的為胞內的MC-LR及藻藍蛋白，UVC照射下兩者在 30 min時的去除率分別為94.70%和83.55%.MC-LR屬于多肽，藻藍蛋白是藍藻主要的捕光色素，分布于類囊體表面，在UV波段有較強的吸收，研究已證實MC-LR和藻藍蛋白對UVC具有高度的敏感性，在UVC照射下MC-LR能快速降解［9］.此外，藍藻光系統Ⅱ(PSⅡ)的D1蛋白對UVC極為敏感，大量研究表明UVC照射會導致Dl蛋白的光降解，使PSⅡ功能下降.藻細胞自身的過氧化防御體系也依賴多種酶類的作用，在UVC透射時亦受到破壞.以上多種反應將藻細胞內部的生命活性物質氧化為類腐殖質物質，促成前期IDOM的峰A、B向峰C、D的轉化(見圖3)，并引起反應中期(30～60 min)藻細胞的大量死亡、破裂和IDOM的釋放，以及 IDOM類蛋白物質的驟減和EDOM類腐殖質物質的突增(見圖3(b)和3(e)).30min時總蛋白去除率為15.46%，而60 min時為64.97%，在60 min時藻細胞群體已經死亡一半以上，到120min時可認為全部死亡.

值得注意的是，胞內葉綠素a對UVC的敏感度較低，說明UVC對活體葉綠素a的降解效果并不明顯，120min時只達到45.66%的去除率，這可能和細胞內多種保護體系以及葉綠素a自身的光敏性有關;而藻藍蛋白在30 min即被降解83.55%，說明UVC在銅綠微囊藻滅活過程中的決定性因子應為藻藍蛋白而不是葉綠素a，采用葉綠素a作為滅活率指標并不適用于高強度的UV滅藻.

2.2.2 氯化反應過程中的多參數特性分析

氯化反應過程中有效物質為HClO，滅活過程中EDOM和IDOM的EEM譜圖見圖5，FI變化如圖6所示.EDOM的EEM變化過程有3個特征峰，分別為峰A、C和D，其中，峰A的強度減弱了14%，說明HClO對藻懸濁液的胞外溶解性類蛋白質物質的降解效果不明顯;而峰C和D的則有較大增加，響應值分別從35AU和30AU增加到860AU和501AU;突躍位于20min前后，說明此時藻細胞大規模破裂和釋放，隨后峰C和D的FI一直增加，說明水中的游離態HClO繼續反應，生成大量類腐殖質物質.IDOM的EEM特性變化則分成兩種趨勢，類蛋白質物質峰A和B的熒光強度均隨著反應減弱，其FI在0～25 min內分別從560 AU和300 AU降低到56AU和49AU;而峰 C和 D的則先升后降，0～25min內分別從150 AU和90 AU上升到870 AU和430AU.反應60 min后IDOM的類蛋白質物質明顯減少，被降解并形成EDOM的腐殖質物質，隨著反應不斷增加且有明顯的殘留.

生化指標以及DOC含量的變化見表3.降解速率為:藻藍蛋白＞總蛋白＞MC-LR＞葉綠素a，說明氯化滅藻機理與UVC的明顯不同.氯化處理時，藻藍蛋白和總蛋白在30min的去除率分別為96.44%和60.36%，而30min之后EDOC含量突然增加，因此認為30 min之前主要為胞內降解.這和HClO具有細胞壁/膜穿透性密切相關，反應前期(0～30min)，HClO和藻細胞接觸后穿透進入細胞，對細胞內部結構和活性物質進行氧化和降解，而這期間藻細胞的完整性仍然維持，但其內部結構和蛋白質等物質卻逐漸被滲入的HClO破壞，宏觀上表現為IDOM的類蛋白質含量(峰A和B)的減少和類腐殖質含量(峰C和D)的增加.反應中期(30～60min)，藻細胞解體并破裂死亡，表現為IDOM的類腐殖質熒光物質含量的驟降和EDOM的相應成分含量的突躍;EEM譜圖顯示在30min時細胞內熒光有機物已經被破壞殆盡，總蛋白去除率為60.36%，可以認為在該時間藻細胞群體已消亡.

圖5 氯化反應過程中銅綠微囊藻的EDOM和IDOM的EEM特征變化Fig.5 EEM properties of extracellular and intracellular dissolved organic matters of Microcystis aeruginosa under chlorination treatment

圖6 氯化反應過程中EDOM和IDOM的FI變化Fig.6 Variation of FI of extracellular and intracellular dissolved organic matters under chlorination treatment

表3 氯化反應過程中生化指標和DOC含量的變化Table 3 Variations of biochemical parameters and DOC content under chlorination treatment

值得注意的是，氯化對活體MC-LR的降解效果有限，投加3 mg/L的Cl2，120 min后MC-LR降解率僅為47.36%.有學者證明純水中MC-LR在氯化作用下降解速率較快［10］;而另有研究表明，NOM會產生競爭效應，對MC-LR的降解有阻礙作用［11］.本實驗滅藻過程中亦有大量NOM產生，因此對MC-LR的降解效果不佳.另外，氯化對藻類有機物的降解并不徹底，產生的NOM仍具有較大的芳香性和熒光性，是典型的消毒副產物前體物，這對后繼水處理過程的安全性會造成一定影響.因此，采用氯化方法作為含藻水的前處理具有一定風險.

3 結論

(1)EEM能較好地表征水中和細胞內所含的熒光性物質，結合生化指標能較全面地描述氯化和UVC的滅藻過程.

(2)氯化和UVC對銅綠微囊藻的滅活及對相關有機物的降解機理不同.UVC的滅活機理主要包括光降解和高級氧化，UVC能有效滅藻，降解胞內外熒光有機物，消除藻藍蛋白和MC-LR，對這兩者的降解既能有效殺滅藻細胞，防止其繼續繁殖增長，又能在短時間內對其所在水體進行無害化處理，但需時較長(120min)，能耗較高.氯化主要依靠HClO穿透進入藻細胞內部進行化學破壞和降解.低濃度氯化處理滅藻時間短，滅活效果好，但會產生較多的類腐殖質物質，同時對MC-LR的去除效果不佳，說明氯化作為含有銅綠微囊藻的水源水的預處理工藝可能具有一定的風險.

后繼研究中，可以就UVC以及氯化處理進行經濟與風險評估以及對比，從而尋找最優化和最有效的處理銅綠微囊藻的方法.

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