不同胃黏膜病變組織中誘導型一氧化氮合酶mRNA的表達

李曉麗,林 銳,李建生,李繼昌

1)鄭州大學第一附屬醫院老年病科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院消化內科鄭州 450052

△女,1977年2月生,碩士,主治醫師,研究方向:消化道腫瘤,E-mail:lxl039921@sina.com

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。胃癌的發生和發展是一個多基因、多因素、多階段的動態順序演變過程,涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活及由此引起的細胞生物學行為的改變。一氧化氮(nitric oxide,NO)是人體內的一種具有生物活性的分子。內源性NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化左旋-精氨酸(L-Arg)與氧分子經多步氧化還原反應產生的[1]。機體對 NO的調節主要是通過對3種不同的NOS來實現的,即內皮型NOS(eNOS)、神經型NOS(nNOS)和誘導型NOS (iNOS),而iNOS誘導產生的大量NO為其產生病理作用的基礎[2]。近年來有研究[3-4]顯示,在炎癥組織及多種腫瘤組織中均可檢測到表達上調的 iNOS,但iNOS在胃癌組織中表達情況的研究結果卻報道不一。作者選取不同病理階段的胃黏膜新鮮組織標本,采用原位分子雜交方法對iNOSmRNA表達情況進行檢測,從分子水平探討iNOS與胃癌發生發展的關系及意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇鄭州大學第一附屬醫院2006年 3月至 2007年 12月外科手術切除胃癌組織標本65例,病理證實為腺癌,其中男 41例,女 24例;年齡(53.5±11.2)歲;腫瘤直徑:＜5 cm 31例,≥5 cm 34例;腫瘤部位:胃賁門部 20例,胃體部 28例,胃竇部17例;組織學分型:高、中分化37例,低分化28例;浸潤深度:未侵及漿膜層 25例,侵及漿膜層及以外 40例;淋巴結轉移情況:無轉移 24例,有轉移 41例;術前均未行放療和化療。另自胃鏡下取35例慢性淺表性胃炎、24例慢性萎縮性胃炎伴腸化生及 21例不典型增生胃黏膜組織標本。慢性淺表性胃炎患者中男20例,女15例,年齡(38.2±10.7)歲;慢性萎縮性胃炎伴腸化生患者中男 13例,女 11例,年齡(50.4±5.6)歲;不典型增生患者中男11例,女 10例,年齡(52.5±6.7)歲。所取新鮮標本均經 40 g/L多聚甲醛液固定,常規脫水、透明、浸蠟、包埋、4μm厚連續切片備用。以上標本均經HE染色及 2位病理學專家確認。

1.2 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA檢測方法 采用原位分子雜交法,原位分子雜交檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。組織切片常規脫蠟至水化;滴加體積分數3%過氧化氫室溫15min,滴加體積分數3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃30min以暴露mRNA片段;滴加預雜交液,37℃4 h;滴加雜交液,覆蓋蠟膜40～42℃恒溫箱過夜;梯度 SSC洗滌,滴加封閉劑,37℃30 min;滴加生物素化兔抗地高辛,37℃60min;滴加ABC,室溫20 min;DAB顯色;蘇木素復染、分化、脫水透明、封片。用不含探針的預雜交液代替雜交液作陰性對照,以已知肺癌陽性染色切片作為陽性對照。

1.3 結果判定[5]iNOSmRNA以細胞胞質著棕黃色為陽性。染色結果綜合染色強度及陽性細胞數行半定量分析。在排除非特異性染色及邊緣效應的前提下,400倍光鏡下觀察并判定。每例觀察 5個視野,每個視野計數 100個細胞。陽性細胞數判定:＜10%0分,10%～1分,25%～2分,50%～3分;染色強度判定:無著色 0分,染色弱 1分,染色清晰 2分,染色強 3分。結果取 2項評分之和:0～1分,陰性;≥2分,陽性。

1.4 統計學處理 應用SPSS 13.0進行分析,不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA陽性表達率的比較采用χ2檢驗,不同病理特征胃癌組織中iNOSmRNA陽性表達率的比較采用 χ2檢驗,檢驗水準 α= 0.05。

2 結果

2.1 不同胃黏膜病變組織中iNOSm RNA的檢測結果 iNOSmRNA主要表達于胃癌細胞,巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞中亦有部分表達。在慢性淺表性胃炎胃黏膜腺體細胞中呈淡棕黃色,在慢性萎縮性胃炎伴腸化生和不典型增生胃黏膜腺體細胞中有中亦有表達。見圖 1和表 1。

2.2 iNOSmRNA表達與胃癌病理特征的關系65例胃癌組織中,iNOSmRNA的陽性表達與組織學分型、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關,而與其腫瘤大小及部位無關。見表 2。

圖1 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA染色結果(原位分子雜交法,×400)

表1 不同胃黏膜病變組織中iNOSmRNA的表達情況

表2 iNOSmRNA表達與胃癌病理特征之間的關系

3 討論

20世紀 80年代,NO才被認識到是人體內的一種具有生物活性的分子。人體內的 NO有 2種來源,一種為非酶生型即來自于體表或攝入的無機氮的化學降解和轉化,一種為酶生型即由NOS催化合成。內源性 NO既有細胞保護功能又具有細胞毒性的雙重作用,其作用方向取決于生成的 NO的量。而iNOS誘導產生的大量NO為其產生病理作用的基礎[2]。現已證實[3-4]iNOS廣泛存在于人和哺乳類動物的多種細胞中,包括多種腫瘤細胞及癌前病變組織細胞中,如肝癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌和 Barrett's食管等。國外研究[6]發現,在炎癥初期,NO主要起抗炎作用,隨炎癥的持續發展,大量的 NO釋放入組織并發揮組織損傷作用。同時,炎癥病灶區存在許多激活的炎性細胞,炎性細胞可被誘導產生iNOS,隨iNOS活性增強將釋放大量NO和超氧化物,NO促進內源性亞硝胺形成,內源性亞硝胺成為感染和炎癥組織發生腫瘤的危險因素。還有研究[7]發現,幽門螺旋桿菌感染可使胃黏膜 iNOS含量增加,而iNOS誘導產生的大量NO及其供體在轉錄水平即可促進炎癥損傷及誘發腫瘤形成。長期慢性炎癥刺激已成為某些腫瘤發生的危險因素之一。該研究結果顯示,iNOSmRNA陽性染色主要位于胃癌細胞胞質中,巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞中亦有部分表達。在慢性淺表性胃炎胃黏膜腺體細胞中呈淡棕黃色弱表達。在慢性萎縮性胃炎伴腸化生、不典型增生胃黏膜腺體細胞中有中、高強度表達。提示,iNOS在促胃癌發生發展過程中遵循腸型胃癌發生模式:淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸化生→不典型增生→胃癌的順序演變過程,即iNOS參與了胃癌形成的全過程,并可能為其早期事件。而長期慢性炎癥刺激又可能成為某些腫瘤發生的更早期危險因素之一。所以,早期阻斷危險因素或消除其產物將為臨床治療提供有效途徑及可靠理論依據。

研究[8]表明,iNOS可通過激活癌基因/抑制抑癌基因、抗凋亡/促增殖、促腫瘤血管生成、促腫瘤細胞侵襲轉移和抑制宿主免疫等多種途徑參與胃癌的形成,iNOS蛋白的高表達與胃腺癌的腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、有無淋巴結轉移及隨訪存活率有關。另有研究[9]表明,NO不僅可限制 T細胞的增生,且可提高前列腺素合成酶的活性而抑制NO介導的巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的作用,從而削弱宿主抗腫瘤作用。該研究結果顯示,iNOSmRNA的表達與胃癌組織學分型、浸潤深度及有無淋巴結轉移均有關,提示iNOS可能作為胃癌形成晚期的一個重要促侵襲轉移因子而加速腫瘤發展演進。但也有相反的研究結果,如Cha等[10]則認為 NO是內源性的血管生成抑制劑。這 2種相反的結果可能是由于局部NO濃度不同所致,還有待于進一步深入研究。

有研究[11]表明,聯合抑制 NO的非甾體抗炎藥較傳統的抗炎藥更具抗癌作用。提示,從分子水平研制更具選擇性的iNOS抑制劑或聯合性抑制劑,將為今后的臨床腫瘤防治工作提供有效途徑和美好前景。

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