胃癌組織中SOCS3與STAT3 mRNA的表達

程 勇,張謝夫,趙春臨,蔣志強

鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科鄭州 450052

#通訊作者,男,1957年 3月生,本科,教授,研究方向:普外科基礎與臨床,E-mail:zhangxiefu@medmail.com.cn

信號傳導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3是一種潛在的細胞質中固有的被JAK磷酸化調節的轉錄因子,能夠直接或間接地上調腫瘤細胞中調控增殖和生存的基因的表達。JAK/STAT是重要的細胞內信號轉導通路,調控細胞生長、分化和凋亡等重要過程。STAT3在各種腫瘤細胞系中持續高表達,如血液和上皮惡性腫瘤,包括乳癌、頭頸部腫瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌[1]。信號傳導抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)3被證實是一種細胞信號因子的抑制因子,通過不同的機制對JAK-STAT通路進行抑制調節[1]。該研究采用RT-PCR技術檢測SOCS3和STAT3mRNA在胃癌組織中的表達情況,探討兩者在胃癌發生中的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集 2009年 9月至 2010年3月鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科手術切除新鮮胃癌標本,液氮保存,各例標本均經病理診斷證實。胃癌患者40例,男25例,女15例;年齡 36～78(58.7± 11.5)歲;早期胃癌8例,進展期胃癌 29例,晚期胃癌 3例;術前均未進行化療和放療。對照組選取同期鄭州大學第一附屬醫院門診胃鏡室經病理證實為正常胃組織標本 20例,患者中男 13例,女 7例;年齡37～80(58.9±11.7)歲。

1.2 主要試劑 Trizol試劑(美國Invitrogen生物科技公司);逆轉錄試劑盒(北京全式金生物科技公司);內參β-actin、STAT3和SOCS3mRNA引物序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成。

1.3 2種組織中STAT3與SOCS3 m RNA的測定方法 取100 mg胃癌組織及正常胃組織用精細剪刀剪碎后,放入研缽中研碎,用加樣槍加入Trizol試劑1 mL研磨勻漿,按照標準的RNA提取步驟提取總RNA。按逆轉錄試劑盒說明分別合成胃癌和正常胃組織的cDNA,提取2μL逆轉錄產物進行擴增。引物序列:β-actin,上游5'-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3',下游5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGT GC-3',擴增產物大小564 bp;STAT3,上游5'-AA CATGCCCATTCGCTTTAC-3',下游5'-TCTCCTTC CCCATACACCTG-3',擴增產物大小317 bp;SOCS3,上游5'-GGACCCAGCATAGGAAAGC-3',下游5'-AAAACCACCCCAACACACAA-3',擴增產物大小482 bp。PCR反應體系(50μL)含cDNA 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,10×BufferⅡ5μL, dNTPs 4μL,DNA聚合酶1μL,ddH2O 36μL。PCR反應條件:94℃5min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1m in,共35個循環;72℃10m in。取PCR反應產物5μL經含1μL EB的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,首先90 V 10min,然后70 V 20m in。于凝膠圖像分析系統(上海微圖儀器科技發展有限公司)下觀察并攝像,以目的基因條帶的灰度與β-actin條帶灰度的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析,采用兩獨立樣本t檢驗比較2種組織中STAT3和SOCS3 mRNA相對表達量有無差異,采用Spearman秩相關分析2種組織中SOCS3和STAT3 mRNA表達之間的相關性,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2種組織中STAT3和SOCS3m RNA的表達見圖1和表1。

2.2 2種組織中STAT3和SOCS3 mRNA相對表達量的相關性分析 STAT3和SOCS3在胃癌組織中的表達呈負相關(r=-0.965,P＜0.001),在正常組織中的表達無相關性(r=-0.093,P=0.698)。

圖1 STAT 3與SOCS3RT-PCR擴增產物凝膠電泳圖

表1 2種組織中STAT 3和SOCS3m RNA相對表達量的比較

3 討論

JAK/STAT信號通路在增殖、分化和凋亡等各種細胞重要功能的調節中起至關重要的作用。當細胞因子/生長因子與 JAK的細胞膜受體結合后,存在于細胞質中的細胞信號傳導分子STAT3的酪氨酸殘基受到磷酸化而激活,形成二聚體的p-STAT3進入到細胞核后與DNA結合從而調節基因的轉錄[2]。STAT的高表達往往出現在惡性增殖性疾病中,此時SOCS系統極有可能處于低反應狀態[3-4]。趙淑華等[5]研究證實:STAT3-siRNA可抑制腫瘤組織中STAT3、VEGF和Survivin蛋白表達,從而抑制腫瘤生長。馬洪濤等[6]研究證實:p-STAT3的表達水平與卵巢上皮性癌的發生及惡性生物學行為密切相關,惡性程度越高,臨床分期越晚,則p-STAT3的表達水平越高。吳民華等[7]發現癌組織中 STAT3和p-STAT3表達水平均明顯高于慢性鼻咽炎組織。SOCS3是SOCS家族中最活躍的成員之一,也是Janus激酶和信號轉錄因子及活化因子信號轉導通路中最重要的抑制因子,SOCS3可被IL-6、紅細胞生成素、瘦素和粒細胞集落刺激因子等多種細胞刺激因子強烈誘導表達[8],負性調節該通路及其下游原癌基因STAT3的信號轉導,阻止細胞的惡性轉化及凋亡抑制。Lu等[8]研究證實:在腫瘤細胞系中SOCS3的表達受到抑制后可導致STAT3的強烈激活。目前已經證實STAT3所調控的目的基因和蛋白參與細胞的生存和增殖[9-11]。國外研究[12]顯示 STAT3在許多腫瘤細胞中持續激活,對STAT3的抑制可以誘導腫瘤細胞凋亡。

該研究結果顯示:STAT3在正常胃組織中的表達低于胃癌組織,SOCS3在正常胃組織中的表達高于胃癌組織,提示STAT3與胃癌的關系密切,參與了胃癌的發生。該研究發現STAT3與SOCS3在胃癌組織中的表達呈負相關,正常組織無相關,提示SOCS3在胃癌中作為一個抑癌基因對STAT3起抑制作用。SOCS3有可能成為胃癌分子靶向治療的靶點,為胃癌的診斷與治療提供理論支持。研究[13-15]發現在許多腫瘤組織中,通過超甲基化使SOCS3沉默可以導致腫瘤的增殖和生長,這為研究STAT3和SOCS3在胃癌中的具體作用機制及其與胃癌的生物學關系提供了新的思路和線索。

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