HPLC法測定醬油中苯甲酸、山梨酸的含量及六省醬油樣品測定結果分析

張國躍 喬蓉霞 齊化元

（1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710061；2.陜西省衛生監督所，陜西西安710054）

醬油是我國使用最廣的調味品之一，由于醬油營養豐富，適于微生物生長繁殖，為了防止醬油腐敗變質，保持醬油的鮮度和良好的品質，醬油中一般都會添加防腐劑苯甲酸、山梨酸。隨著現代食品工業的發展，食品添加劑的超量和超范圍使用現象十分嚴重，對食品添加劑的檢測也越來越受到人們的重視。本實驗用高效液相色譜法同時測定醬油中苯甲酸、山梨酸的含量，方法簡便、快捷，適用于大批量樣品的快速檢測。本次試驗共收集到六個省份共計180批樣品（每省30批），測定結果表明，六個省份醬油中均有不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情況。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀，2487紫外檢測器，Waters empower工作站（美國Waters公司），C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；Sartorius AGME235S電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 對照物質

苯甲酸標準儲備液（國家標準物質，GBW（E）130035 2008-3）、山梨酸標準儲備液（國家標準物質，GBW（E）100007 09002），均由中國計量科學研究院提供。

1.3 試劑及試液

試驗用水：符合GB/T 6682-92二級水標準；甲醇：色譜純，經0.45μm微孔濾膜過濾；其它試劑均為分析純。

1.4 標準溶液的制備

1.4.1 苯甲酸標準儲備液 精密稱取苯甲酸約0.10g，加碳酸氫鈉溶液（20g/L）5mL，加熱溶解，移入100mL量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量約為1mg/mL，作為儲備溶液。

1.4.2 山梨酸標準儲備液 國家標準物質，GBW（E）100007 09002，中國計量科學研究院提供，濃度：1.00mg/mL。

1.4.3 苯甲酸、山梨酸標準混合使用液 精密吸取苯甲酸、山梨酸各10.0mL，放入100mL量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL，經0.45μm微孔濾膜過濾。

1.5 試樣處理

稱取本品5.0g，加水約40mL，用稀氨水調節pH值至約7，加水定容至50mL量瓶中，離心，取上清液，經0.45μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

1.6 高效液相色譜條件

色譜柱：C18250mm×4.6mm，5～10μm；流動相：甲醇∶0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；檢測器：紫外檢測器，波長：230nm。

2 方法與結果

2.1 線性范圍考察

分別精密吸取苯甲酸、山梨酸混合標準溶液（0.102mg/mL、0.100mg/mL）2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀測定，以進樣量（X）為橫坐標，以峰面積積分值（Y）為縱坐標進行回歸，回歸方程分別為Y=3E+06X-80251，r=1；Y=5E+06X-158903，r=1。結果顯示，進樣量在0.20396～3.50947μg和0.2～3.0μg范圍內，與峰面積呈良好的線性關系，見圖1、2。

圖1 苯甲酸線性關系圖

圖2 山梨酸線性關系圖

2.2 精密度試驗

精密吸取苯甲酸、山梨酸標準溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，重復測定7次，結果RSD%均為0.51%，表明精密度良好。

2.3 穩定性試驗

取同一份樣品，分別在0、1、2、4、8、12h測定，計算含量的RSD%；取同一份樣品，分別在0、1、2、4、6、8、12、18h測定，苯甲酸、山梨酸含量的RSD%分別為0.78%、3.40%，穩定性好。

2.4 空白試驗

取不含苯甲酸、山梨酸的樣品按照1.4.1項下的方法制備試樣，測定，空白試樣中未出現與苯甲酸、山梨酸標準品保留時間相同的色譜峰，見圖3。

圖3 高效液相色譜圖

2.5 重復性試驗

精密稱取同一樣品共6份，按照1.4.1項下的方法制備試樣，測定，計算RSD%。結果苯甲酸平均含量為0.8129mg/kg，RSD=1.24%；山梨酸平均含量為0.4784mg/kg，RSD=2.10%，見表1～2。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱取上述樣品約2g，共6份，分別加入濃度分別為1.0198mg/mL和1.00mg/mL的苯甲酸、山梨酸對照品溶液各1mL，按照4.1項下的方法制備試樣，測定，結果苯甲酸平均回收率為98.31%，RDS=1.43%；山梨酸平均回收率為90.26%，RDS=2.82%，按下式計算回收率。見表3、4。

2.7 最低檢出濃度的確定

精密稱取空白樣品約1g，將1.4.2項下的混合標準溶液（濃度：苯甲酸0.1056mg/mL、山梨酸0.1mg/mL）稀釋10倍，在上述空白樣品中分別加入0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，照1.4.1項下的方法制備試樣，結果在加入混合標準稀釋溶液1.0mL試樣中，檢測到與苯甲酸、山梨酸標準品保留時間相同的色譜峰，色譜峰面積分別為117481和130408，基線噪音信號為1.724，最低檢出濃度為苯甲酸0.21mg/kg，山梨酸0.20mg/kg。

表1 苯甲酸重復性試驗測定結果

表2 山梨酸重復性試驗測定結果

表3 苯甲酸回收率測定結果

表4 山梨酸回收率測定結果

3 討論

此次檢測工作是按照國家食品藥品監督管理局的統一部署所進行的食品安全性評價工作，共采集到在安徽、湖南、湖北、福建、廣東、海南等六個省份流通環節使用的180批醬油樣品，涉及到生產企業43家。各省檢測到苯甲酸、山梨酸批數見表5。

結果顯示：苯甲酸含量在0.05～0.94g/kg；山梨酸含量在0.02～0.59g/kg。見圖4、5。

HPLC法測定醬油中苯甲酸、山梨酸的方法，樣品經稀釋、調節pH后定容，處理方法簡單、快捷[1]，但有些樣品由于濃度大、顏色深（如老抽類醬油），稀釋后的顏色仍然較深，黏度偏大，可做進一步稀釋[2-4]。在進行大批量樣品測定時，注意色譜柱的保護，可每測定一定量的樣品后，進行反沖，避免色譜柱過早毒化。張冬青[5]研究將樣品經酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸發乙醚后定量溶解，再進行液相色譜測定。該方法提純效果較好，具有處理簡單、檢測快速準確、易用于實際樣品的測定，可用于在測定峰附近有雜質峰樣品的測定[6]。

表5 各省檢測到苯甲酸、山梨酸批數

圖4 苯甲酸含量頻數分布圖

圖5 山梨酸含量頻數分布圖

[1]衛生部食品衛生監督檢驗所.食品中山梨酸苯甲酸的測定方法[S].GB/TT5009.29-2003.

[2]國家標準化管理委員會.中華人民共和國國家標準：食品衛生檢驗方法理化部分[S].北京：中國標準出版社，1997：378.

[3]李明元.高效液相色譜法及其在食品分析中的應用[M].北京：北京大學出版社，1988：54.

[4]王晶.食品安全快速檢測技術[M].北京：化學工業出版社，2002.

[5]張冬青.采用高效液相色譜法同時快速測定醬油中的苯甲酸鈉、山梨酸[J].中國調味品，1997,10（22）：28-30.

[6]辛丹敏.高效液相色譜法在食品分析和藥物分析中的應用研究[D].西南大學，2009：26-28.