人骨髓間充質干細胞與臍靜脈內皮細胞體外共培養的研究

劉春曉 吳歡歡 馬慧雨 康寧 曹誼林 肖苒 尹寧北

·論著·

人骨髓間充質干細胞與臍靜脈內皮細胞體外共培養的研究

劉春曉 吳歡歡 馬慧雨 康寧 曹誼林 肖苒 尹寧北

目的觀察人骨髓間充質干細胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）與臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）體外共培養對hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影響。方法分離鑒定hBMSCs和hUVECs，將hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培養，倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長特性和細胞相容性，Matrigel實驗觀察共培養對hUVECs體外血管形成能力的影響。將hBMSCs成骨誘導7 d后，茜素紅染色觀察共培養對其成骨分化能力的影響。結果hBMSCs與hUVECs體外共培養細胞相容性良好，Matrigel實驗顯示共培養組形成的毛細血管狀結構較單一細胞組多。成骨誘導的hBMSCs中，共培養組茜素紅染色陽性，單一細胞組茜素紅染色陰性。結論hBMSCs與hUVECs具有良好的細胞相容性，在共培養體系中，未誘導的hBMSCs能促進形成毛細血管狀結構，已成骨誘導的hBMSCs成骨礦化能力增強。

組織工程骨髓間充質干細胞臍靜脈內皮細胞共培養

組織工程骨的預制技術為骨缺損的修復提供了新的方法。但是體外構建的單純組織工程骨，移植入體內后依靠組織液滲透僅能營養100 μm以內的細胞[1]，中央的細胞供血和供氧受到限制，出現成骨不良及成骨質量不佳等問題，使得組織工程骨無法有效修復體積較大的骨缺損。因此，血管化是解決組織工程骨臨床應用問題的關鍵。

研究發現，在骨缺損修復的過程中，成骨細胞與血管內皮細胞之間存在著密切的聯系[2]。本實驗將成骨誘導后的人骨髓間充質干細胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）和臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）直接共培養，觀察兩種細胞的生物相容性，探討hUVECs對hBMSCs成骨作用及hBMSCs對hUVECs成血管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Ficoll淋巴細胞分離液（G&E公司，瑞典）；胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、DMEM培養基（HyClone公司，美國）；肝素、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、PBS緩沖液（Sigma公司，美國），EGM-2（Lonza公司，瑞士）；鼠抗人OPN（Abcam公司，英國）；流式抗體CD31-FITC、CD34-PE、FITC和PE同型對照（BD公司，美國）；Accuri C6流式細胞儀（Accuri公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；骨髓血與臍帶來源于無全身性疾病的臨床志愿者。

1.2 hBMSCs的分離培養和鑒定

1.2.1 hBMSCs的分離純化和擴增

采用密度梯度離心法分離hBMSCs，將經過抗凝處理的骨髓血緩慢加入含有等體積Ficoll分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min，吸取中間乳白色云霧狀單個核細胞層，PBS沖洗2遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入基礎培養基（DMEM-LG培養基，10%胎牛血清，1%青、鏈霉素），反復吹打成單細胞懸液，接種于25 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，隔天換液。7～10 d后待細胞生長至80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代，按1×104cells/cm2密度接種于新的培養瓶中。本實驗使用第3～5代的hBMSCs。

1.2.2 HBMSCs的多向誘導分化

1.2.2.1 成骨誘導

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接種于6孔培養板中，每孔內預置3枚1 cm×1 cm蓋玻片，加入2 mL成骨誘導培養基（DMEM-HG培養基，10%胎牛血清，10-8mmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L抗壞血酸，1%青、鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養箱內培養，隔天換液。倒置顯微鏡觀察細胞形態。誘導7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3遍，取出蓋玻片，進行骨橋蛋白（Osteopetin，OPN）免疫細胞化學檢測。取第3代未成骨誘導的hBMSCs爬片作為陰性對照。

1.2.2.2 成脂肪誘導

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接種于6孔培養板中，每孔內加入2 mL成脂肪誘導培養基（DMEM-HG培養基，10%胎牛血清，0.5 μM氫化可的松，0.5 μM IBMX，60 μM消炎痛，10 μg/mL胰島素，1%青、鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養箱內培養，隔天換液。倒置顯微鏡觀察細胞形態。誘導10 d后，鈣-福爾馬林固定10 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3次，60%異丙醇處理2 min，加入油紅O染液，置于脫色搖床震蕩30 min后，鏡下觀察。

1.3 hUVECs的原代培養和鑒定

1.3.1 hUVECs的原代分離和擴增

無菌條件下取新生兒臍帶（長約20 cm），找出臍靜脈，注入0.1%膠原酶Ⅱ，置于預熱PBS燒杯中，37℃孵育5 min，收集消化液，注入EGM-2培養基，再次沖洗靜脈管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入EGM-2培養基，輕輕吹打均勻，接種于75 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，24 h后更換培養液，去除未貼壁的細胞，隔天換液，細胞生長融合至80%～90%時，按上述方法傳代。本實驗使用第2～3代的hUVECs。

1.3.2 hUVECs的表面標志物檢測

取第2代hUVECs，PBS沖洗3遍，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液，計數，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸，樣品管和對照管各加入100 μL細胞懸液，含1×106個細胞。樣品管加鼠抗人熒光標記單克隆抗體CD31-FITC、CD34-PE各10 μL，對照管加入10 μL FITC或PE標記的鼠IgG1同型對照抗體作為陰性對照，4℃避光孵育30 min。PBS重懸，2 000 r/min離心3 min，重復洗滌3遍。1%多聚甲醛固定，定容至200 μL，4℃避光保存，次日流式細胞儀檢測細胞表面標志物。

1.4 hBMSCs和hUVECs的直接共培養

1.4.1 Matrigel測定共培養體系中內皮細胞血管形成能力

將Matrigel置于4℃過夜融解，取30 μL加入96孔板，37℃孵育1 h，使Matrigel聚合成膠。取未誘導的hBMSCs與hUVECs，分別消化，調整細胞密度為1×106cells/mL，設立1個實驗組及2個對照組，每組復設5孔，實驗組于96孔板每孔內各加入100 μL hBMSCs與hUVECs細胞懸液，使hBMSCs與hUVECs比例為1∶1，對照組僅加入100 μL hBMSCs或100 μL hUVECs，用培養基補至200 μL。實驗過程保持冰上操作。每2 h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，檢測hBMSCs對hUVECs成血管能力的影響。

1.4.2 茜素紅染色檢測共培養對成骨誘導的hBMSCs功能的影響

取成骨誘導7 d的hBMSCs與hUVECs，分別消化，調整細胞密度為1×105cells/mL，于6孔板每孔內各加入1 mL hBMSCs與hUVECs細胞懸液，使hBMSCs與hUVECs比例為1∶1，以單純hBMSCs為對照組。置于37℃、5%CO2培養箱內培養，細胞貼壁后更換為不含成骨誘導成分的培養基，隔天換液。倒置顯微鏡觀察共培養的細胞形態和生長情況。7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3次，每孔加入1 mL 1%茜素紅-Tris-HCL（pH 4.7），37℃孵育30 min，用PBS沖洗數次，鏡下觀察。

2 結果

2.1 hBMSCs形態學觀察及鑒定

2.1.1 hBMSCs原代及傳代培養

原代細胞接種48 h后，可見hBMSCs在培養瓶底散在分布，伸展成梭形，與周圍圓盤狀血細胞相互混雜。4 d后，可見細胞呈成纖維細胞樣集落生長。5～10 d，細胞生長迅速，形成大集落，呈漩渦狀排列。各個集落之間逐漸融合，不發生接觸抑制，集落生成細胞生長速度顯著快于散在的細胞。傳代后，細胞進入快速增殖期，形態更加單一，體積增大呈紡錘型，細胞排列有規則的方向性（圖1）。

圖1 原代hBMSCs體外培養第14天（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1Primary cultured hBMSCs 14 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.1.2 OPN染色鑒定hBMSCs成骨分化能力

hBMSCs在體外成骨誘導7 d，細胞體積變大，形態變為多邊形，核大，核仁清晰，細胞內顆粒增多，細胞外基質（Extra Cellular Matrixc，ECM）分泌旺盛，局部細胞相互連接成膜狀。OPN免疫細胞化學染色可見胞漿中有棕色顆粒，為陽性，未成骨誘導的hBMSCs未見有陽性表達（圖2）。

圖2 體外成骨誘導7 d（OPN染色，倒置相差顯微鏡，100×）Fig.2Seven days after induced osteogenesis (OPN STAINING,Inverted phase contrast microscope,100×)

2.1.3 油紅O染色鑒定hBMSCs成脂肪分化能力

hBMSCs加入成脂肪誘導培養基后，細胞形態發生明顯變化，細胞體積變大，逐漸由長梭形變為多邊形，橢圓形等脂肪細胞樣形態，胞漿內可見明顯脂肪滴，且細胞增殖明顯減慢。油紅O染色可見胞漿內呈紅色，為陽性，說明細胞內出現脂肪滴，對照組未見陽性表達（圖3）。

2.2 hUVECs的形態觀察及表面標志物鑒定

圖3 體外成脂肪誘導10 d（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.3hBMSCs 10 days after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,100×)

hUVECs為單層貼壁生長，大部分在原代分離24 h后完全貼壁，相差顯微鏡下見細胞成團或散在貼附在培養瓶上，呈梭形或多角形，胞核橢圓居中，互不重疊。3～5 d后融合，低倍鏡下呈典型的鋪路石樣外觀（圖4）。流式細胞儀檢測CD31陽性率為92.6%，CD34陽性率為28.6%，提示為成熟內皮細胞（圖5）。

圖4 原代hUVECs體外培養4 d（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.4Primary culture hUVECs 4 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

圖5 流式細胞儀檢測hUVECs表面標志Fig.5Flow cytometry analysis of endothelial phenotype of hUVECs

2.3 hBMSCs與hUVECs共培養

2.3.1 共培養大體形態觀察

倒置顯微鏡下觀察可見在直接接觸培養條件下，兩種細胞均貼壁生長并維持各自細胞形態，hBMSCs呈長梭形，有粗大的角狀突起，體積較大; hUVECs呈卵圓形，類似鵝卵石狀，體積較小。隨著時間延長，相鄰細胞彼此貼靠融合，相互交織生長，未發生接觸抑制，無排斥、吞噬等現象（圖6）。

圖6 hBMSCs與hUVECs以1∶1共培養2 d（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.6hBMSCs 2 days after directly co-cultur with hUVECs in a ratio of 1∶1 (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.2 Matrigel血管形成能力檢測

接種即刻可見細胞呈圓形分散在Matrigel內，2～3 h后可見細胞伸出偽足向周圍擴散，4 h后可見細胞間相互銜接形成閉合環狀結構，即管腔樣毛細血管網狀結構，提示Matrigel實驗陽性，說明hUVECs保持成血管能力。共培養組形成了廣泛的管腔樣毛細血管網狀結構（圖7），比單純hUVECs組（圖8）形成的毛細血管網狀結構致密粗厚，單純hBMSCs組僅有少量不連續的管腔樣結構（圖9），提示共培養的hUVECs血管形成能力優于單一細胞培養。

圖7 hBMSCs與hUVECs以1∶1接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.7hBMACs and hUVECs 4 hours after seeding onto Matrigel coated wells (Inverted phase contrast microscope,40×)

圖8 hUVECs單獨接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.8hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖9 hBMSCs單獨接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.9hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.3 hBMSCs茜素紅染色

成骨誘導的hBMSCs與hUVECs共培養7 d后可見實驗組于皿底有白色礦化結節形成，結節中心細胞重疊，呈放射狀排列，周邊細胞稀疏，茜素紅染色為深紅色，提示ECM中出現大量鈣鹽沉積，包裹細胞形成鈣結節。單純hBMSCs對照組未出現鈣結節，茜素紅染色陰性（圖10）。

圖10 成骨誘導7 d的hBMSCs與hUVECs共培養7 d后（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.10hBMSCs 7 days with hUVECs co-culture after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,40×)

3 討論

組織工程骨為臨床骨缺損的治療提供了新的思路。骨組織工程技術應用自體種子細胞與可降解支架材料結合，可構建與人體骨組織結構相同的活性骨組織，修復機體骨缺損，同時避免了臨床上現行的自體骨移植技術“以創傷修復創傷”的弊端，以及異體骨移植的感染、免疫排斥等副作用[3]。BMSCs因其多向分化能力以及成骨分化潛能成為骨組織工程重要的種子細胞[4-5]。目前，體外構建的單純組織工程骨是種子細胞和生物材料的復合體，本身沒有營養來源，宿主血管長入的速度不能滿足種子細胞的營養和供氧需求，因此，形成的新生骨的數量和質量均不能滿足臨床修復大范圍骨缺損的需要。

血管化在骨損傷修復和再生過程中是極為重要的，新生血管不僅是運送氧氣、營養物質及運走代謝廢物的途徑，它還是參與骨修復調控的信號分子、生長因子和細胞運輸通過的重要通道。研究發現，組織工程骨的血管化程度與新骨形成的數量呈正相關，同時血管能運走生物材料代謝物，使成骨速率與材料降解率達到同步[6]。因此，組織工程骨的有效血管化成為骨組織工程邁向臨床應用的關鍵環節。目前，組織工程骨血管化方法通常包括：將血管內皮細胞與成骨及其前體細胞聯合培養[7]，添加促血管生成的生長因子[8]，將血管束植入組織工程骨[9]，動靜脈吻合環繞組織工程骨[10]等。研究表明，上述方法能提高組織工程骨構建的效率和骨缺損的修復效果。

本實驗以hUVECs與未誘導和成骨誘導的hBMSCs共培養，有效地模擬了體內微環境。研究結果顯示，hBMSCs與hUVECs具有良好的細胞相容性，未誘導的hBMSCs能協助并促進hUVECs形成毛細血管狀結構；已成骨誘導的hBMSCs在使用成骨誘導因子的情況下加入hUVECs，可以維持成骨表型，成骨活性和礦化形成能力增強。其機制可能是：①hBMSCs可表達血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF在血管發生和形成過程中有重要的作用[11]，可促進內皮細胞的增殖和血管形成能力[12]；②未誘導的hBMSCs在與內皮細胞共培養時，有部分向血管肌層細胞分化，協助內皮細胞形成血管管腔[13]，有助于新生血管的穩定，增強其長期存活率[14]；③hBMSCs促內皮細胞分泌骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP-2）[15]，促進已成骨誘導的hBMSCs進一步向成骨細胞分化[16-17]。但是，兩種細胞在直接接觸培養時通過什么途徑形成功能相互促進，以及各誘導因子發揮作用的機制，目前仍未闡明，還有待進一步探討和研究。

本實驗證實，直接共培養可分別提高血管內皮細胞的成血管功能和成骨誘導的BMSCs的成骨礦化能力。BMSCs-支架復合物體外聯合血管內皮細胞共培養使組織工程骨預血管化，可以為種子細胞提供正常的營養和生長調控，是骨組織工程血管化的理想方法。

[1]Davies JE.Mechanisms of endosseous integration[J].Int J Prosthodont, 1998,11(5):391-401.

[2]Kanczler JM,Oreffo RO.Osteogenesis and angiogenesis:the potential for engineering bone[J].Eur Cell Mater,2008,2(15):100-114.

[3]馬曉榮,祁佐良.組織工程骨血管化的研究進展[J].組織工程與重建外科雜志,2006,2(6):344-346.

[4]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,284(5411): 143-147.

[5]劉廣鵬,李宇琳.成骨誘導的人骨髓基質干細胞生物安全性評價[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(4):181-184。

[6]Santos MI,Reis RL.Vascularization in bone tissue engineering: physiology,current strategies,major hurdles and future challenges [J].Macromol Biosci,2010,10(1):12-27.

[7]Yu H,VandeVord PJ,Mao L,et al.Improved tissue engineered bone regeneration by endothelial cell mediated vascularization[J].

Biomaterials,2009,30(4):508-517.

[8]肖彩雯,范先群,周慧芳,等.轉染人血管內皮生長因子基因的組織工程骨修復眼眶壁骨缺損的實驗研究[J].組織工程與重建外科雜志,2009,5(2):65-69.

[9]王永剛,裴國獻.血管束植入在組織工程骨血管化構建中的作用[J].解放軍醫學雜志,2007,32(1):26-28.

[10]Lokmic Z,Stillaert F,Morrison WA,et al.An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent,highly vascular,tissueengineered construct[J].FASEB J,21(2):511-522.

[11]Kaigler D,Krebsbach PH,Polverini PJ,et al.Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells[J].Tissue Eng,2003,9(1):95-103.

[12]Villars F,Bordenave L,Bareille R,et al.Effect of human endothelial cells on human bone marrow stromal cell phenotype:role of VEGF [J].J Cell Biochem,2000,79(4):672-685.

[13]Au P,Tam J,Fukumura D,et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells facilitate engineering of long-lasting functional vasculature [J].Blood,2008,111(9):4551-4558.

[14]Koike N,Fukumura D,Gralla O,et al.Tissue engineering:creation of long-lasting blood vessels[J].Nature,2004,428(6979):138-139.

[15]Ying X,Zhe X,Hellem S,et al.Endothelial cells influence the osteogenic potential of bone marrow stromal cells[J].Biomed Eng Online,2009,8:34.

[16]Bouletreau PJ,Warren SM,Spector JA,et al.Hypoxia and VEGF up-regulate BMP-2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells:implications for fracture healing[J].Plastic Reconstru Surg,2002,109(7):2384-2397.

[17]Kaigler D,Krebsbach PH,West ER,et al.Endothelial cell modulation of bone marrow stromal cell osteogenic potential[J].FASEB J,2005, 19(6):665-667.

Experimental Study on the Co-Culture of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Vitro

LIU Chunxiao1,WU Huanhuan1,MA Huiyu2,KANG Ning1,CAO Yilin1,XIAO Ran1,YIN Ningbei1.1 Plastic Surgery Hospital（Institute）,CAMS,PUMC,Beijing 100041,China;2 Dental Hospital,Jiamusi University,Heilongjiang 154007,China.Corresponding author:YIN Ningbei(E-mail:yin_nb@126.com).

ObjectiveTo observe the effects of co-culture of human bone marrow mesenchymal stromal cells(hBMSCs) and human umbilical vein endothelial cells(hUVECs)in vitro on the osteogenesis and angiogenesis respectively.Methods Isolated and identified hBMSCs and hUVECs were directly co-cultured by a ratio of 1∶1.Growth and compatibility of the cells were observed with inverted phase contrast microscope.Matrigel experiment was used to test the ability of hUVECs to form networks of capillary-like structures under co-culture.After 7 days of osteogenic induction,the effect of co-culture on the osteogenesis of hBMSCs was assessed by Alizarin-Red staining.ResultsThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.hUVECs co-cultured with hBMSCs exhibited denser microcapillary-like networks in Matrigel experiment than hUVECS.Osteogenic-induced hBMSCs co-cultured with hUVECs showed positive by Alizarin-Red staining,while it was negative in osteogenic-induced hBMSCs.ConclusionThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.In the coculture system,the ability of hUVECs to form microcapillary-like networks can be enhanced,so as the calcification activity of osteogenic-induced hBMSCs.

Tissue engineering;Bone marrow mesenchymal stromal cells;Umbilical vein endothelial cells;Co-culture

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）02－0065－06

2011年2月1日；

2011年3月7日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.002

北京市科技計劃項目（D09080703660901）。

100041北京市中國醫學科學院整形外科醫院（劉春曉，吳歡歡，曹誼林，肖苒，尹寧北）；154007黑龍江省佳木斯市佳木斯大學附屬口腔醫院（馬慧雨）。

尹寧北（E-mail:yin_nb@126.com）。