殘耳軟骨細胞與脂肪干細胞共培養體內構建軟骨的實驗研究

張潔 蔣海越 何樂仁 趙延勇 楊慶華 韓娟 宋宇鵬

殘耳軟骨細胞與脂肪干細胞共培養體內構建軟骨的實驗研究

張潔 蔣海越 何樂仁 趙延勇 楊慶華 韓娟 宋宇鵬

目的驗證殘耳軟骨細胞與脂肪來源的間充質干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）共培養，體內構建軟骨的可行性。方法分離培養同一先天性小耳畸形患者來源的殘耳細胞及脂肪干細胞。24只裸鼠隨機分為4組：①實驗組，接種殘耳細胞及脂肪干細胞，兩種細胞以1∶1比例混合，細胞濃度為5.0×107cells/mL；②對照組1，接種單純殘耳軟骨細胞，細胞濃度為5.0×107cells/mL；③對照組2，接種單純ADSCs，細胞濃度為5.0×107cells/mL；④對照組3，接種單純殘耳軟骨細胞，細胞濃度為2.5×107cells/mL。每組接種6只裸鼠，每只接種0.2 mL。體內培養10周后取材。通過對新生組織的大體觀察、測量濕重、糖胺多糖含量測定、組織學及免疫組化染色等方法對各組新生軟骨進行比較。結果實驗組、對照組1與對照組3新生為不同組織量的軟骨樣組織，對照組2形成纖維樣組織；實驗組平均濕重及糖胺多糖含量達到對照組1的88%以上，對照組3平均濕重低于對照組1的40%；HE染色示實驗組、對照組1與對照組3的標本均有軟骨陷窩形成，對照組2未見軟骨陷窩形成；Ⅱ型膠原免疫組化染色示實驗組、對照組1與對照組3均可見Ⅱ型膠原表達；對照組2未見Ⅱ型膠原表達。結論體內共培養條件下，殘耳軟骨微環境可有效促進脂肪干細胞向軟骨方向分化，殘耳軟骨細胞與脂肪干細胞共培養體內構建軟骨具備可行性。

共培養脂肪干細胞殘耳軟骨細胞體內

小耳畸形是整形外科常見的先天體表畸形，嚴重影響患者的容貌和身心健康，耳廓再造術是目前最有效的治療手段，而耳廓再造術的關鍵之一是耳廓軟骨支架的制備。目前常用的耳廓支架制備材料為自體軟骨組織制備的軟骨耳廓支架，與人工高分子成品耳廓支架相比，具有組織相容性好，無排異反應等優點，臨床效果良好。組織工程的發展為耳廓再造提供了新的途徑。BMSCs已被證實具有向軟骨方向分化的能力[1-2]，隨后也發現ADSCs也具有向軟骨分化并形成軟骨樣組織的能力[3]。ADSCs是一類增殖能力強、具有多向分化潛能的成體干細胞，研究證實該細胞體外大規模擴增后仍保留向軟骨方向分化的能力[4-5]。ADSCs與BMSCs相比，具有來源廣，易獲得，創傷小，純化率高，體外增殖速度快等優點，是構建軟骨組織理想的種子細胞。相關研究表明，BMSCs在軟骨細胞提供的軟骨微環境中能有效地被誘導向軟骨方向分化并形成軟骨[6-7]。本研究試圖探索殘耳軟骨細胞微環境能否誘導ADSCs向軟骨細胞分化，以及殘耳軟骨細胞與脂肪干細胞共培養體內構建軟骨的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗標本為中國醫學科學院整形外科醫院外耳整形再造中心外耳再造術中廢棄的殘耳軟骨組織及脂肪組織，與患者家屬簽訂知情同意書，患者年齡為5～20歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪干細胞的分離與培養

取術中廢棄的皮下脂肪組織，剝除肉眼可見的筋膜，小血管等脂肪周圍組織后，剪成1mm3大小組織塊，加入終濃度為0.075%的Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司，美國），37℃搖床內消化40 min，120 r/min；10%FBS（Gibco公司，美國）的低糖DMEM培養基終止消化，200目濾網過濾，1 500 r/min離心5 min，去上清后加入完全培養基重懸，計數后以細胞濃度為5×104cell/cm2接種培養皿內，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱（Thermo公司，美國）內培養，每2～3天更換一次培養液。待細胞融合達85%后傳代。收集第3代細胞備用。

1.2.2 殘耳軟骨細胞的分離與培養

取術中廢棄的殘耳軟骨組織，去除軟骨組織膜及周圍組織后剪成2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，加入4倍體積量的2%膠原酶（Invitrogen公司，美國），37℃搖床內消化10～12 h，200目濾網過濾，2 000 r/min離心8 min，去上清后加入完全培養基重懸，計數后以細胞濃度為1×104cells/cm2接種培養皿中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養，每2～3天更換一次培養液。待細胞融合達85%后傳代。收集第2代細胞備用。

1.2.3 可降解支架材料準備

電子天平稱取3 g固體粉末Pluronic F-127（Sigma公司，美國），加入10 mL無血清高糖DMEM培養基（Hyclone公司，美國），充分攪拌、溶解，126℃高溫高壓下消毒處理，4℃存放備用。

1.2.4 實驗分組

實驗分為4組，每組接種6只裸鼠（6周，雌性）（北京維通利華公司），每只接種0.2 mL，共接種24只。實驗組：殘耳軟骨細胞與ADSCs以1∶1的比例混合，細胞接種終濃度為5.0×107cells/mL；對照組1：單純軟骨細胞，細胞接種終濃度5.0×107cells/mL；對照組2：單純ADSCs，細胞接種終濃度5.0×107cells/mL；對照組3：單純軟骨細胞，細胞接種終濃度2.5×107cells/mL。

1.2.5 細胞接種

按以上實驗分組中的細胞種類、細胞比例以及終濃度將細胞與0.2 mL 30%的Pluronic F-127冰上混勻，用20 mL注射器注射到裸鼠皮下。10周后取材。

1.2.6 新生組織相關評價指標的檢測

形態學觀察新生組織的形態、大小和色澤，用鑷子鉗夾判斷新生組織的彈性；稱重，比較各組濕重平均值的差異；阿利辛藍比色法檢測各組糖胺多糖（GAG）含量平均值（組織糖胺多糖總含量阿爾新藍比色法定量檢測試劑盒，上海杰美公司）；將組織塊以4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，HE染色，觀察細胞基本形態和組織結構；甲苯胺藍染色及Safranin O染色觀察軟骨組織的異染程度及基質中GAG的分泌情況；Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察各組標本Ⅱ型膠原表達情況。

1.2.7 統計學處理

數據均用x±s表示，應用SPASS 17.0軟件對數據進行t檢驗，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 大體觀察

實驗組、對照組1、對照組3注射部位均有乳白色軟骨樣組織形成；實驗組與對照組1新生組織的大小相仿，外觀和彈性類似于正常軟骨；對照組3新生組織量明顯低于實驗組和對照組1，組織彈性也較差。對照組2未生成軟骨樣組織，而是形成淡黃色，質軟的纖維樣組織（圖1）。

2.2 新生組織平均濕重比較

實驗組：177±14.4 mg；對照組1：200.67±13.42 mg；對照組2：73.3±8.6 mg；對照組3：78±8 mg。實驗組與對照組3具有相同的初始殘耳軟骨細胞接種量，實驗組平均濕重達到對照組1的88.5%，而對照組3平均濕重僅為對照組1的38.87%（P＜0.05）。證明相同的初始殘耳軟骨細胞量，在共培養實驗組生成的軟骨組織量要比單獨培養組高（圖2）。

2.3 新生組織平均GAG含量比較

實驗組中單位重量新生組織中糖胺多糖含量的平均值達到對照組1的91.2%，對照組3僅達到對照組1的66.4%（圖3）。

2.4 組織學染色

HE染色示除對照組2形成纖維樣組織，未發現軟骨陷窩外，實驗組、對照組1與對照組3的標本均有軟骨陷窩形成，實驗組與對照組1形成的軟骨陷窩形狀大小與正常軟骨組織相類似，分布較均勻。對照組3軟骨陷窩明顯變大，且形狀、大小差異較大，陷窩間距增寬，且分布不均（圖4）；Safranin O、甲苯胺藍染色顯示，實驗組、對照組1與對照組3均為陽性，實驗組與對照組1著色深度較一致，對照組3著色較淺（圖5）。Ⅱ型膠原免疫組化染色證實3組樣本均有Ⅱ型膠原表達，對照組3著色較淺（圖6）。

圖1 各組標本大體觀察Fig.1Gross view of the specimens in all groups

圖2 各組標本濕重Fig.2Wet weight in all groups

圖3 各組標本GAG含量Fig.3GAG content in all groups

圖4 各組HE染色（400×）Fig.4 HE staining for of the specimens in all groups(400×)

圖5 各組Safranin O染色及甲苯胺藍染色（200×）Fig.5Safranin O and Toluidine Blue staining for the specimens in all groups(200×)

圖6 各組Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.6Collagen typeⅡimmunohistochemistry staining for the specimens in all groups(200×)

3 討論

構建組織工程軟骨耳廓最主要的問題是種子細胞的來源問題，小耳畸形患者的殘耳軟骨組織往往較小，不足以提供足量的殘耳軟骨細胞，而過度體外擴增，軟骨細胞將逐漸失去表型及分泌軟骨基質的能力，轉化為成纖維細胞，失去成軟骨的能力[7-8]。因此，具有強大增殖和多向分化能力的干細胞，尤其是來源廣，易獲得，純化率高，體外增殖速度快的脂肪干細胞有望成為構建軟骨組織的理想種子細胞。脂肪干細胞向軟骨細胞誘導的實驗研究較多，但傳統的誘導方法需要大量的生長因子，誘導方案較昂貴，從實驗研究到臨床運用的轉化較難。

研究發現，軟骨細胞微環境能有效促進多分化潛能的干細胞向軟骨方向分化，形成軟骨樣組織并修復缺損[9-10]。微環境作用的機制可能為：軟骨細胞分泌TGF-β、IGF等生長因子，誘導干細胞向軟骨方向分化[7]；相鄰細胞間的相互作用[8]；分泌軟骨微環境特異性細胞外基質，作用于細胞的增殖、分化、黏附及細胞間信號傳導等。另有文獻報道，與軟骨細胞共培養的BMSCs能向軟骨方向分化，在體外形成軟骨樣組織[9]。因此，我們將殘耳軟骨細胞與ADSCs體內共培養，探索殘耳軟骨細胞微環境能否誘導ADSCs向軟骨細胞分化，以及殘耳軟骨細胞與ADSCs共培養體內構建軟骨的可行性。

實驗結果表明，除對照組2外，其余各組均能形成軟骨組織。實驗組與對照組1所形成組織的組織量相近，組織學染色結果類似，色澤彈性與正常耳廓軟骨無明顯區別。而對照組3形成的軟骨樣組織量明顯少于實驗組和對照組1，且彈性較差。對照組2未形成軟骨樣組織。實驗組與對照組3含有相同的起始殘耳軟骨細胞數，然而前者形成組織的平均濕重及GAG含量分別達到對照組1的88.5%與91.2%；后者平均值明顯小于對照組1平均值。由此可推斷，殘耳軟骨細胞微環境對脂肪干細胞的軟骨方向分化具有確切的促進作用，共培養組中的脂肪干細胞能替代一定量的殘耳軟骨細胞形成軟骨樣組織，殘耳軟骨細胞與脂肪干細胞共培養體內構建軟骨是可行的。

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The Experimental Studies of the Tissue Engineering Cartilage by Co-Culturing Microtia Chondrocytes and Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Vivo

ZANG Jie,JIANG Haiyue,HE Leren,ZHAO Yanyong,YANG Qinhua,HAN Juan，SONG Yupeng.Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:JIANG Haiyue(E-mail:jianghaiyue@sohu.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of the chondrogenesis by co-culturing microtia chondrocytes and human adipose tissue-derived stem cells in vivo.MethodshADSCs and microtia chondrocytes were isolated in vitro.24 nude mice were randomly divided into 4 groups:①Exp group,injected with microtia chondrocytes and hADSCs by a mixing ratio of 1∶1 and the cell concentration was 5.0×107cells/mL;②Ctrl 1 group,injected with only microtia chondrocytes and the cell concentration was 5.0×107cells/mL;③Ctrl 2 group,injected with only hADSCs and the cell concentration was 5.0×107cells/ mL;④Ctrl 3 group,injected with only microtia chondrocytes and the cell concentration was 2.5×107cells/ml.6 nude mice were injected each group at a dose of 0.2 mL.All samples were harvested 10 weeks after culturing in vivo.Gross observation, average wet weights,glycosaminoglycan(GAG)quantification,histology and immunohistochemisty were used to evaluate the chondrogenesis of all groups.ResultsIn Exp,Ctrl 1,and Ctrl 3 group,all the specimens formed homogeneous cartilagelike tissue with typical histological structure at different extent.In Ctrl 2 group,the specimens formed fiber-like tissue. Average wet weight and GAG content of specimens in Exp group were more than 88%of Ctrl 1 group while they were less than 40%in Ctrl 3 group.Cartilage lacuna was detected by HE staining in Exp,Ctrl 1 and Ctrl 3 group at different extent, but not in Ctrl 2 group.Collagen type II was detected by immunohistochemistry in Exp,Ctrl 1 and Ctrl 3 group at different extent,but not in Ctrl 2 group.ConclusionMicrotia chondrocytes could promote chondrogenesis of ADSCs in vivo under the co-culturing system.Tissue engineering cartilage by co-culturing microtia chondrocytes and ADSCs in vivo is feasible.

Co-culture;ADSCs;Microtia chondrocytes;In vivo

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）02－0075－05

2011年2月26日；

2011年3月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.004

100144北京市中國醫學科學院整形外科醫院。

蔣海越（E－mail：jianghaiyue@sohu.com）