EPO治療干預對RPE細胞氧化損傷的保護作用*

趙 穎 姜文靜 牛膺筠

1.青島大學醫學院附屬市立醫院眼科，山東 青島 266011；2.青島大學醫學院附屬海慈醫院眼科，山東 青島 266033；3.青島大學醫學院附屬醫院眼科，山東 青島 266003

年齡相關性黃斑變性是我國主要致盲眼病之一，嚴重危害患者的視力。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷是年齡相關性黃斑變性病程的重要病理機制[1]。近期研究發現，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）具有抑制凋亡[2]、抗脂質過氧化[3]、神經保護[4]等多種生物學作用。筆者前期報道了EPO對RPE細胞凋亡的抑制作用[5]，本實驗通過建立體外培養的RPE細胞氧化損傷模型，檢測EPO干預前后RPE細胞活力以及凋亡相關因子表達的變化，進一步探討其細胞保護機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

EPO、MTT試劑（美國Sigma生物技術公司）；Caspases-9單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組織化學試劑盒（北京中山生物試劑公司）；人RPE細胞(美國細胞培養收集公司，ARPE-19細胞株)；DMEM/F12培養基，新生牛血清，胰蛋白酶，青霉素和鏈霉素（GIBCO生物技術公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人RPE細胞的體外培養 詳見文獻[5]。

1.2.2 實驗分組及建立RPE細胞氧化損傷模型 人RPE傳代細胞隨機分為5組，每組4孔：①正常對照組；②過氧化氫氧化損傷模型組（600 μmol/L過氧化氫損傷，不加EPO藥物干預）；③過氧化氫＋10 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，10 IU/mL EPO藥物干預）；④過氧化氫＋20 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，20 IU/mL EPO藥物干預）；⑤過氧化氫＋40 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，40 IU/mL EPO藥物干預）。

1.2.3 MTT檢測 細胞接種于96孔板，接種密度2×104個/mL，每孔200 μL，每組4孔。培養24 h使細胞融合約80%～90%；將原培養液吸出，按上述分組換入含有不同成份的DMEM/F12培養液，繼續培養24 h；更換為正常培養液培養24 h。棄去培養液，每孔加入MTT終濃度為0.05 mg/mL的無血清培養液，培養3 h，棄去培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，置搖床振蕩10 min，用不含細胞的DMEM/F12培養液調零，應用DG3022型酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處讀取各孔吸光度（A490）值。

1.2.4 免疫組織化學法檢測Caspases-9蛋白表達 將RPE細胞按密度2×105個/mL接種于6孔板中，孔內預置4 mm×4 mm的蓋玻片，培養24 h，觀察到細胞融合約80%～90%；將原培養液吸出，按上述分組換入含有不同成份的DMEM/F12培養液，繼續培養24 h；更換為正常培養液培養24 h。吸出培養液，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，用質量分數4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍。取出孔內的蓋玻片，細胞面向上置于載玻片上。滴加0.3% H2O2室溫10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，復合消化液室溫10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，正常山羊血清室溫10 min，加一抗（鼠抗人Caspases-9單克隆抗體）37℃ 2h，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，加二抗37℃ 20 min，SP法染色，DAB顯色，脫水，透明，封片。陽性細胞胞膜和胞質呈棕黃色染色。空白對照，用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 EPO對過氧化氫氧化損傷人RPE細胞活性的影響

MTT法測定各組細胞A490值反映細胞活性變化見表1。氧化損傷組細胞活性顯著降低，與正常組相比較差異有極顯著性（t=11.8692，P＜0.01）。EPO各組的細胞活性均明顯增高，與氧化損傷組比較，10 IU/mL EPO干預組、20 IU/mL EPO干預組、40 IU/mL EPO干預組細胞活性逐漸升高差異均有極顯著性（t值分別為 5.6569、5.7056、9.4299，P＜0.01）。

表1 EPO對過氧化氫損傷人RPE細胞活性的影響

2.2 EPO對過氧化氫損傷人RPE細胞表達Caspase-9的影響

正常組Caspases-9蛋白表達于細胞膜和細胞質上，呈少量特異性淺黃色著色。氧化損傷組Caspases-9呈強陽性表達，表現為特異性棕黃色著色。氧化損傷組與正常組比較，表達升高，差異有極顯著性（t=147.5805，P＜0.01）。經不同濃度的EPO干預，Caspase-9的表達不同程度的減弱，在40 IU/mL EPO干預組減弱的最為明顯。與氧化損傷組比較，10 IU/mL EPO干預組、20 IUmL EPO干預組、40 IU/mL EPO干預組表達逐漸下降，差異有統計學意義（t值分別為：18.7409、61.8718、54.9153，P＜0.01）。見表2。

表2 EPO對過氧化氫損傷人RPE Caspases-9蛋白表達的影響（平均光密度值，，n＝4）

表2 EPO對過氧化氫損傷人RPE Caspases-9蛋白表達的影響（平均光密度值，，n＝4）

注：n=4，氧化損傷組和正常組比較，aP＜0.01， EPO組和氧化損傷組比較，bP＜0.01

分組 Caspases-9 t P正常組 3.2±0.2 -過氧化氫氧化損傷組 36.2±0.4a 147.5805 0.000010 IU/mL EPO組 30.2±0.5b 18.7409 0.000020 IU/mL EPO組 18.7±0.4b 61.8718 0.000040 IU/mL EPO組 16.4±0.6b 54.9153 0.0000

3 討論

隨著我國人口老齡化趨勢的加重，年齡相關性黃斑變性的患病率不斷上升。而研究表明，年齡相關性黃斑變性的發病機制與RPE細胞的氧化損傷有關[6]。RPE細胞吞噬感光細胞外節會產生過度氧化反應，損傷RPE細胞，同時破壞RPE細胞之間構成的血－視網膜外屏障，誘發一系列的病理過程[7]。本實驗室前期研究發現，EPO對小鼠視網膜光損傷有治療作用[8]、對RPE細胞氧化損傷有保護作用，可以抑制凋亡、增強超氧化物歧化酶的活性，從而起到抗氧化作用。因此，本研究通過制作人RPE細胞氧化損傷模型，添加不同濃度的EPO進行藥物干預，進一步研究其保護機制。

本實驗使用MTT法檢測RPE細胞活性。MTT測定是一種有色反應，當細胞培養液中加入MTT后，能被活細胞攝入，經細胞內線粒體呼吸鏈酶分解成甲瓚，經過分光光度計的檢測細胞活性[9]。本研究結果發現氧化損傷組細胞活性顯著低于正常組，RPE細胞的氧化損傷，破壞了線粒體膜，細胞發生致死性改變。經過EPO藥物干預的RPE細胞，細胞活性明顯增高，提示不同劑量的EPO均對RPE細胞有保護作用。其中40 IU/mL EPO干預組的細胞活性最高，與正常組接近，說明40 IU/mL EPO能夠拮抗過氧化氫對RPE細胞的氧化損傷。

本實驗室前期研究已證實EPO對RPE細胞氧化損傷的保護作用通過抑制凋亡來完成。細胞凋亡是指細胞在凋亡基因控制下主動的一種細胞死亡過程[10]。凋亡的發生由細胞內外多種不同的誘因激發細胞自身凋亡基因的連鎖反應而啟動[11]。Caspase-9作為Caspases蛋白酶家族的上游成員，在凋亡的介導中起重要的作用[12]。目前對于RPE細胞凋亡的上游啟動階段尚無明確的研究結果。本實驗研究發現，氧化損傷組Caspases-9蛋白呈陽性表達，較正常組表達升高，顯示在RPE凋亡過程中Caspase-9介導的凋亡途徑起到重要的作用。而外源性EPO干預可以減少Caspase-9的表達，其抗凋亡機制可能與此有關。

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