馬鈴薯蛋白組分的分離提取和功能性質研究

崔竹梅，黃海珊，秦歡歡，樸金苗，齊 斌

馬鈴薯蛋白組分的分離提取和功能性質研究

崔竹梅，黃海珊，秦歡歡，樸金苗，齊 斌*

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

采用透析與等電點沉淀相結合的工藝方法提取分離馬鈴薯塊莖蛋白組分；并對其理化性質和功能性質進行檢測。結果顯示：此提取工藝流程合理易行，馬鈴薯塊莖酸性蛋白組分和堿性蛋白組分的得率分別為0.535%、0.741%；純度分別為92.5%、89.2%；酸性蛋白組分沉降系數5S，分子質量82kD；堿性性蛋白組分沉降系數8S，分子質量140kD。SDS-PAGE電泳圖譜表明5S蛋白組分有1條亞基帶；8S蛋白組分有4條亞基帶。5S蛋白組分的表面疏水性、吸油能力、乳化性顯著高于8S蛋白組分；而8S蛋白組分的總巰基含量以及起泡性高于5S蛋白組分。馬鈴薯蛋白組分可以作為功能食品的蛋白添加原料。

馬鈴薯蛋白；提取分離；功能性質

植物性蛋白對于人類營養具有重要意義。馬鈴薯資源豐富，我國年產量約6000萬t，居世界前列，但加工量只占總產量的10%左右。目前對馬鈴薯的研究主要集中在糖蛋白patatin、蛋白酶抑制劑和低分子質量抗菌肽等的生理作用[1-4]。而馬鈴薯蛋白多被作為淀粉生產過程中的廢料成分，食品利用較少。馬鈴薯貯藏蛋白主要分為酸性組分和堿性組分，前者主要成分為糖蛋白patatin，后者主要成分是20～24kD 蛋白酶抑制劑和多肽。

關于馬鈴薯濃縮蛋白和分離蛋白的制備[5-8]、純化[9-11]及功能性質[12-13]研究較多，而對酸性蛋白組分和堿性蛋白組分的分離提取研究較少。Ralet等[14]采用離子交換層析法獲得了酸性和堿性蛋白組分，并對它們的溶解性、熱穩定性和乳化性等部分性質做了研究。此法制備的馬鈴薯蛋白組分的純度較高，但成本高、得率低，不適用于規模生產。

馬鈴薯蛋白營養均衡，是極具潛力的食品蛋白來源。目前國內外未見馬鈴薯酸性蛋白組分和堿性蛋白組分同時分離提取的工藝流程以及沉降系數、表面疏水性等性質的研究報道。因此本實驗對此進行研究，以期可提高馬鈴薯的產品附加值和綜合利用率，解決馬鈴薯加工廠淀粉廢液直接排放的污染問題，同時為馬鈴薯蛋白的深入研究及產品開發參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯 市售。

三(羥甲基)氨基甲烷(T r i s)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、亞硫酸氫鈉(SBS)、過硫酸氨(AP)、四甲基乙二氨(TEMED)、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、苯甲基磺酰氟(PMSF) 美國Sigma公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Delta 320型精密pH計 瑞士Mettler Toledo公司；AOLPHA 1-2LD Plus型冷凍干燥機 德國Christ公司；電泳儀、MilliQ超純水裝置 美國Bio-Rad公司；Prote.o.meLab XL-Ⅰ分析型超速離心機 美國Beckman公司；AKTA primplus液相色譜系統液相系統 GEAmersham公司；RF - 5301PC熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯塊莖總蛋白的提取

總蛋白的提取參照文獻[12]并做修改。

新鮮馬鈴薯切成片，加少量0.5g/100mL的Na2SO3溶液打成勻漿，濾去薯渣后6000r/min離心10min。調節上清液至pH4.0，離心取沉淀。將沉淀調節至pH7.0，凍干得粗蛋白粉。

1.3.2 馬鈴薯蛋白組分的分離工藝流程

將馬鈴薯粗蛋白粉用10g/100mL NaCl溶液溶解，8000r/min離心20min。取上清液透析36h，4 ℃、5000r/min離心20min，所得沉淀凍干得馬鈴薯堿性蛋白組分。再調節離心所得上清液至pH4.0，4℃、8000r/min離心20min，所得沉淀為馬鈴薯酸性蛋白，調節至pH7.0，凍干備用。具體操作流程見圖1。

1.3.3 馬鈴薯蛋白組分理化性質

1.3.3.1 蛋白得率和純度的測定

蛋白質濃度測定：采用Brandford法；總蛋白質含量：采用微量凱氏定氮法(N×6.25)。

微量凱氏定氮法測定總蛋白的純度；SDS-PAGE電泳測定各蛋白組分的純度，SDS-PAGE采用不連續垂直板狀凝膠電泳，凝膠厚度1mm，濃縮膠5%，分離膠12%，凝膠分析用Bio-Rad公司的Quatity-One軟件。

1.3.3.2 蛋..白純化和沉降系數的測定

采用AKTA primplus液相色譜系統進行蛋白純化(裝seperdex75 10/300GL柱)。1mL樣液上樣，洗脫液的Tris-HCl(0.1mol/L，pH 7.5)，洗脫流速0.8mL/min。測沉降系數的測定，參見Wolf法[15]。

1.3.4 馬鈴薯蛋白組分食品功能性質

1.3.4.1 表面疏水性的測定

表面疏水性測定，采用熒光探針ANS法[16]，略有改動。用0.01mol/L pH 7.0緩沖液配制不同質量濃度的蛋白質溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)和8.0mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)溶液。檢測前取20μL ANS溶液加到4mL蛋白質溶液中，混合均勻，迅速測定混合液的熒光強度。激發波長為390nm，發射波長為470nm。以蛋白質濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.3.4.2 巰基含量測定

參照Kachanechaia等[17]的方法測定巰基含量。取蛋白樣品60mg溶于10mL Tris-Gly緩沖液(含0.004mol/L EDTA、8mol/L尿素，pH8.0)，10000r/min離心10min，取上清液測游離巰基(—SHF)和總巰基(—SHT)含量。

1.3.4.3 吸油性的測定

取0.5g蛋白樣品于刻度10mL離心管中，加入5mL色拉油，混勻1min，在室溫下靜置30min，然后3000r/min離心30min，測量其上清液體積，用5mL減去上清液體積即為樣品吸油量。

1.3.4.4 起泡性的測定

0.5 g樣品溶解到100mL 蒸餾水中，調節至pH7.0，然后在10000r/min 的組織搗碎勻漿機中均質2min，記錄均質停止時泡沫的體積。

1.3.4.5 乳化性的測定

用0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制0.1g/100mL的蛋白液，取45mL蛋白液與15mL大豆油于高速組織搗碎機中均質(10000r/min)1min，制成白色乳狀液。立即從乳液底部吸取0.5mL乳濁液，加25mL SDS(0.1g/100mL)，充分混勻后在500nm波長處測其吸光度A500nm，即得：乳化活性(EAI)=A500nm×100。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖蛋白的提取

經凱氏定氮分析，實驗所用馬鈴薯塊莖蛋白含量為1.97%(以鮮質量計)。采用Na2SO3水溶液浸提法的蛋白得率低于FeCl3沉淀法[7]，但水提法簡單無毒，適用于食品生產。

馬鈴薯蛋白酸性組分在pH4時溶解性較小，而堿性蛋白組分的在整個pH值范圍內溶解度都較高，所以不能用堿溶酸沉法分離馬鈴薯酸性、堿性蛋白組分。但兩者在鹽溶液中的溶解性有所不同，堿性蛋白組分在純水中的溶解性明顯低于鹽溶液，可通過稀釋蛋白鹽溶液或透析法使堿性蛋白組分析出。采用透析和等電點沉淀相結合的工藝流程制備馬鈴薯酸性和堿性蛋白組分，獲得了較理想的得率，酸性蛋白為0.535%，堿性蛋白為0.741%(表1)。

表1 馬鈴薯蛋白的得率和純度Table 1 Yield and purity of potato tuber protein fractions

如用馬鈴薯粗蛋白粉為對照，則酸性蛋白的得率為37.7%，堿性蛋白為52.2%。酸性蛋白蛋白得率低，但純度較高，達到92.5%；而堿性蛋白的純度略低，為89.2%。同時本工藝流程簡單可行，無外來污染物的引入，在工業生產中可以用超濾技術取代透析過程，提高生產效率。

2.2 馬鈴薯蛋白組分沉降系數的測定

圖2 馬鈴薯酸性蛋白沉降系數Fig.2 Sedimentation coefficient of the acid protein fraction from potato tuber

圖3 馬鈴薯堿性蛋白沉降系數Fig.3 Sedimentation coefficient of the alkaline protein fraction from potato tube

馬鈴薯塊莖蛋白酸性組分和堿性組分的沉降系數和分子質量的研究未見報道。蛋白組分經脫鹽純化后進行超速離心，由圖2可知，酸性蛋白組分的沉降系數為5S，堿性蛋白組分沉降系數為8S；它們的分子質量分別為82、140kD。

2.3 馬鈴薯蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖譜

SDS - PAGE已廣泛應用于蛋白質分析測定，要獲得較好的SDS - PAGE 電泳分辨率，電泳條帶應分布在膠的中央，且條帶分布清晰。預實驗研究發現采用5%的濃縮膠，12%的分離膠濃度進行馬鈴薯蛋白SDSPAGE電泳效果最佳。

圖4為馬鈴薯總蛋白的電泳圖譜，從圖譜上可以看出馬鈴薯蛋白條帶分布均勻，出現13條分布清晰的亞基條帶，比Partsia等[5]研究認為的5條亞基帶要多。馬鈴薯塊莖蛋白電泳圖譜可分成兩個集中區域，上方區域中有分子質量為60、41kD 的兩條主帶；下方區域中出現4個主帶，分子質量分別為16、22、23、25kD。馬鈴薯酸性蛋白主要為41kD蛋白(圖5)，即糖蛋白patatin。patatin 為二聚體蛋白，其總分子質量約為82kD，與2.2節中超速離心分析所得結果一致。堿性蛋白組分主要是16～25kD 的蛋白酶抑制劑和多肽。

圖4 馬鈴薯總蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of potato total protein

圖5 馬鈴薯酸性蛋白、堿性蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE patterns of the acid and alkaline protein fraction of potato tuber

2.4 馬鈴薯塊莖酸性蛋白和堿性蛋白理化性質研究

疏水相互作用對蛋白質的穩定性、構象和功能具有重要意義，是維持蛋白質三級結構最重要的作用力。熒光探針ANS法是一種經典的評價蛋白質表面疏水性的方法。蛋白質的疏水性，與其表觀作用如表面張力、乳化性能等具有很好的相關性。二硫鍵是天然存在于蛋白質中唯一的側鏈交聯共價鍵，在單體蛋白質中，二硫鍵的形成是蛋白質折疊的結果，二硫鍵含量的多少會影響蛋白質的熱穩定性和凝膠性。蛋白質表面疏水性以及游離巰基含量的變化，直接影響其溶解性、起泡性和乳化性等功能特性。

表2 5S和8S蛋白組分的表面疏水性和巰基含量Table 2 Surface hydrophobicity and sulfhydryl content of isolated 5S and 8S fractions of potato storage proteins

Ellman’s試劑檢測3種蛋白質，由表2可知，8S蛋白中的巰基總含量和二硫鍵顯著高于5S蛋白；同時8S組分的表面疏水性比5S 的要小得多，這可能與其含有更多的二硫鍵有關，二硫鍵使蛋白質肽鏈的空間結構更為緊密，把蛋白質的疏水端包裹在分子內部。其他導致8S 組分表面疏水性較小的原因將在后續實驗中繼續研究。

由表3可知，馬鈴薯蛋白具有良好的食品功能性質，與大豆分離蛋白相關指標[18]接近，比報道的甘薯蛋白的指標[19]略低。馬鈴薯5S組分具有良好的吸油能力、乳化性，可考慮應用于脂肪含量較高的食品如肉制品、乳制品等。馬鈴薯蛋白5S組分的起泡性卻顯著低于8S蛋白組分，8S 組分的起泡性達到了1.85mL/g。蛋白質的乳化性質與其表面疏水性存在弱的正相關[20]，同時蛋白質的高溶解度也是良好的起泡能力的先決條件。

表3 5S和8S蛋白組分的功能性質Table 3 Functional characterizations of the isolated 5S and 8S fractions of potato proteins

3 結 論

馬鈴薯蛋白營養均衡，其貯藏蛋白組分可分成酸性蛋白組分和堿性蛋白組分，研究其蛋白提取工藝和功能性質有其實際意義。本實驗得出以下結論：

通過透析和等電點沉淀法結合的工藝流程來分離提取馬鈴薯塊莖酸性和堿性蛋白組分，得率達到了0.535%、0.741%，純度達到了92.5%、89.2%。 可進一步優化工藝流程，提高各蛋白組分的得率。

馬鈴薯蛋白酸性和堿性組分的沉降系數分別為5S、8S，分子質量分別為82、140kD。SDS-PAGE 圖譜顯示5S蛋白組分有1條亞基帶，分子質量41kD；8S蛋白組分有4條主帶，分子質量16～25kD。

5S蛋白組分的表面疏水性、吸油性、乳化性高于8S蛋白；而8S 蛋白組分的性巰基含量、起泡性明顯高于5S蛋白組分。可根據它們的功能特點，在食品中進行添加應用的研究。

[1]PARK Y, CHOI B H, KWAK J S, et al. Kunitz-Type Serine protease inhibitor from potato (Solanum tuberosum L. cv. Jopung) [J]. Journal of Agricultrual and Food Chemistry, 2005, 53(16): 6491-6496.

[2]LITTLE T J, HOROWITZ M, FEINLE-BISSET C. Role of cholecystokinin in appetite control and body weight regulation[J]. Obesity Reviews, 2005, 6(4): 297-306.

[3]DANA S, LEWIS B. Efficacy of SlendestaTMpotato protein Extract: USA, KHBB-017-047[P]. 2007-03 -05..

[4]KIM M H, PARK S C, KIM J Y, et al. Purification and characterization of a,,table serine,,ase inhibitor from the tubers of new potato variety Golden Valley [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 346(3): 681-686.

[5]PARTSIA Z, KIOSSEOGLOU V. Foaming properties of potato proteins recovered by complexation with carboxymethylcellulose[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2001, 21: 69-74.

[6]VIKELOUDA M, KIOSSEOGLOU V. The use of carboxymethylcellulose to recover potato proteins and control their functional properties[J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18(1): 21-27.

[7]BARTOVA V, BARTA J. Chemical composition and nutritional value of protein concentrates isolated from potato (Solanum tuberosum L.) fruit juice by precipitation with ethanol or ferric chloride[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(19): 9028-9034.

[8]LOKRA S, HELLAND M H, CLAUSSEN I C, et al. Chemical characterization and functional properties of a potato protein concentrate prepared by large-scale expanded bed adsorption chromatography[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41 (6): 1089-1099.

[9]RALET M C, GUEGUEN J. Fractionation of potato proteins: solubility, thermal coagulation and emulsifying properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2000, 33(5): 380-387.

[10]SUH S G, PETERSON J E, STIEKEMA W J, et al. Purification and characterization of the 22-kilodalton potato tuber proteins[J]. Plant Physiol, 1990, 94(1): 40-45.

[11]RACUSEN D, FOOTE M. A major soluble glycoprotein of potato tubers[J]. Journal of Food Biochemistry, 1980, 4(1): 43-52.

[12]樸金苗, 都鳳華, 齊斌. 馬鈴薯分離蛋白凝膠的制備及其性質研究[J]. 食品科學, 2009, 30(22): 108-111.

[13]樸金苗, 都鳳華, 齊斌. 馬鈴薯分離蛋白的溶解性和乳化性研究[J].食品科學, 2009, 30(17): 91-94.

[14]RALET M C, GUEGUEN J. Fractionation of potato proteins: solubility, thermal coagulation and emulsifying properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2000, 33(5): 380-387.

[15]WOLF W J, BRIGGS D R. Ultracentrifugal investigation of the effect of neutral salts on the extraction of soybean proteins[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1956, 63(1): 40-49.

[16]URUAKPA F O, ARNTFIELD S D. Surface hydrophobicity of commercial canola proteins mixed with κ-carrageenan or guar gum[J]. Food Chemistry, 2006, 95(2): 255-263.

[17]KACHANECHAIA T, JANTAWATA P, PICHYANGKURAB R, et al. The influence of chitosan on physico-chemical properties of chicken saltsoluble protein gel[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(1): 74-83.

[18]張根生, 岳曉霞, 李繼光, 等. 大豆分離蛋白乳化性影響因素的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(7): 48-51.

[19]MU Taihua, TAN Szesze, XUE Youlin. The amino acid composition, solubility and emulsifying properties of sweet potato protein[J]. Food Chemistry, 2009, 112(4): 1002-1005.

[20]王璋, 許時嬰, 湯堅, 等. 食品化學[M]. 中國輕工業出版社, 2009: 162.

Isolation and Characterization of Potato Protein Fractions

CUI Zhu-mei，HUANG Hai-shan，QIN Huan-huan，PIAO Jin-miao，QI Bin*
( College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Potato protein fractions was isolated by combing dialysis and isoelectric precipitation, and their partial physicochemical and functional properties were determined. The results showed that the isolation procedure was feasible, with the acid and alkaline protein fraction of potato tuber accounting for 0.535% and 0.741%, respectively, and their purity were 92.5% and 89.2%, respectively. The acid protein fraction , s sedimentation coefficient was 5S, consisting principally of one subunit band with apparent MW41 kD. The alkline protein fraction ,s sedimentation coefficient was 8S, with 4 subunit bands detected in the SDSPAGE pattern, and apparent MW 25, 23, 22 kD and 16 kD, respectively. The 5S fraction showed greater surface hydrophobicity, fat absorption, and emulsifying capacity, while lower sulfhydryl content, foaming capacity. The 8S fraction showed greater sulfhydryl content and foaming capacity than 5S fraction. The protein fractions of potato were the best choice for functional foods.

potato protein；isolation；functional properties

TS201.21

A

1002-6630(2011)03-0076-05

2010-05-24

崔竹梅(1977-)，女，博士研究生，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程。E-mail：zhumeicui0623@yahoo.cn

*通信作者：齊斌(1965-)，男，教授，博士，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程。 E-mail：qibin65@126.com