脈沖電場(chǎng)對(duì)荔枝汁中釀酒酵母的殺滅效果

劉新雨，曾新安，賈 曉

脈沖電場(chǎng)對(duì)荔枝汁中釀酒酵母的殺滅效果

劉新雨，曾新安*，賈 曉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

研究不同電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間的脈沖電場(chǎng)(PEF)對(duì)荔枝汁中釀酒酵母菌的殺滅效果，并探討能量輸入對(duì)釀酒酵母殺滅效果的影響。結(jié)果顯示：電場(chǎng)強(qiáng)度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)均能增大釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)；對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期釀酒酵母進(jìn)行殺菌，表明荔枝汁中處于4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的釀酒酵母對(duì)電場(chǎng)敏感度不同，由強(qiáng)到弱依次為穩(wěn)定期＞對(duì)數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。PEF對(duì)釀酒酵母的滅菌效果隨著電場(chǎng)能量輸入的增加而增強(qiáng)。

高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)；荔枝汁；滅菌

荔枝作為四大“嶺南佳果”之一，味甜鮮美、汁多肉嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，具有一定的藥效和滋補(bǔ)作用。但是由于荔枝生產(chǎn)地域集中、采摘期短，對(duì)新鮮荔枝進(jìn)行即時(shí)深加工具有重要意義[1]。荔枝汁作為加工產(chǎn)品的一種形式，如果不經(jīng)過合適的處理將很容易變質(zhì)[2]。然而，荔枝汁熱敏性很強(qiáng)，普遍認(rèn)為不適合熱滅酶、熱殺菌等熱處理工藝。

高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)(pulsed electric field，PEF)技術(shù)是一種正在興起的非熱加工技術(shù)，具有非熱(低溫)高效連續(xù)殺滅微生物的特點(diǎn)，對(duì)食品天然營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味等影響較小[3-5]，能符合果汁滅菌要求[6-10]。因此PEF技術(shù)能夠較好地保存果汁的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，延長(zhǎng)果汁的保存期[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。國(guó)外已有工業(yè)規(guī)模果蔬汁電場(chǎng)滅菌方面的研究[11]。本實(shí)驗(yàn)主要研究高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)對(duì)荔枝汁中釀酒酵母的滅菌效果，初步探討電場(chǎng)能量輸入、滅菌效果和荔枝汁處理過程中溫度升高之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

荔枝汁由廣東省帝濃酒業(yè)有限公司提供，冷藏貯存，實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心，取上清液備用；釀酒酵母菌種由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

麥芽瓊脂培養(yǎng)基(麥芽膏粉130g/L、瓊脂15g/L、氯霉素0.1g/L) 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；氯化鈉(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

721 型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋 上海滬南科學(xué)儀器廠；高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)連續(xù)處理裝置(主要由示波器、脈沖發(fā)生器、處理室、負(fù)載電阻、恒流泵組成。脈沖電場(chǎng)參數(shù)為：電場(chǎng)強(qiáng)度0～35kV/cm 連續(xù)可調(diào)，脈沖頻率為1.0kHZ，脈沖寬度25μs。處理室電極材料為不銹鋼，絕緣部分為聚四氟乙烯，容量為0.02mL，波形為平方波) 華南理工大學(xué)脈沖電場(chǎng)研究組自行設(shè)計(jì)開發(fā)。

1.4 方法

不同生長(zhǎng)環(huán)境及不同培養(yǎng)基都會(huì)對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)有一定的影響。為了研究PEF對(duì)荔枝汁中處于各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的釀酒酵母的滅菌效果，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)釀酒酵母在荔枝汁中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定。

1.4.1 菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1.4.1.1 菌種的恢復(fù)培養(yǎng)

凍干菌種裝在小試管內(nèi)，用劃線法將菌種轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。30℃恒溫培養(yǎng)48h，使菌種復(fù)壯。

1.4.1.2 擴(kuò)大培養(yǎng)

在培養(yǎng)好的試管中加入無(wú)菌液體培養(yǎng)基，用無(wú)菌接種環(huán)將斜面上的菌落剝離，搖勻，制成菌懸液，接種到無(wú)菌的容量為1L并裝有300mL 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃、180r/min 振蕩培養(yǎng)20h，此時(shí)培養(yǎng)液渾濁。

1.4.1.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將分光光度計(jì)波長(zhǎng)調(diào)整到560nm，預(yù)熱30min。以未接種的荔枝汁培養(yǎng)液校正零點(diǎn)。取盛有300mL 無(wú)菌荔枝汁培養(yǎng)液的1000mL錐形瓶1個(gè)，加入振蕩培養(yǎng)20h的細(xì)菌培養(yǎng)液30mL，30℃恒溫培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的36h內(nèi)每隔2 h用無(wú)菌移液管從瓶中吸取培養(yǎng)液樣，在波長(zhǎng)560nm處測(cè)定OD值。

1.4.2 滅菌效果測(cè)定

采用混合平板培養(yǎng)法于36℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并計(jì)算PEF處理前后荔枝汁中的活菌總數(shù)。滅菌效果采用菌數(shù)減少指數(shù)表示。

式中：N為脈沖電場(chǎng)處理后的菌落總數(shù)/(CFU/mL)；N0為脈沖電場(chǎng)處理前的菌落總數(shù)/(CFU/mL)。

1.4.3 PEF能量輸入計(jì)算

脈沖個(gè)數(shù)以及總處理時(shí)間的計(jì)算見公式(2)、(3)[12-13]。

式中：n為脈沖個(gè)數(shù)；t為總處理時(shí)間；V為處理室體積/mL；f為脈沖頻率/Hz；u為流速/(mL/s)；τ為脈沖持續(xù)時(shí)間/μs。

電場(chǎng)輸入能量計(jì)算見公式(4)[14-16]為：

式中：Q為輸入能量/(J/m3)；E為電場(chǎng)強(qiáng)度/(V/m)；為一定溫度下樣品的電導(dǎo)率/(S/m)；t為總處理時(shí)間/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝汁中釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線

圖1 釀酒酵母在荔枝汁中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由圖1可以看出，釀酒酵母在荔枝汁中培養(yǎng)0～10h內(nèi)，生長(zhǎng)緩慢，處于調(diào)整期。隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，曲線呈快速上升趨勢(shì)。培養(yǎng)28h時(shí)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。然后在很短時(shí)間內(nèi)由穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，生長(zhǎng)曲線急劇下降。本實(shí)驗(yàn)以荔枝汁中培養(yǎng)釀酒酵母菌5、20、30、35h分別代表荔枝汁中釀酒酵母生長(zhǎng)的4個(gè)不同時(shí)期。

2.2 PEF對(duì)荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母滅菌效果

PEF對(duì)微生物的作用效果影響因素較多，其中最重要的因素是電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間。實(shí)驗(yàn)首先以這兩個(gè)因素對(duì)滅菌效果的影響進(jìn)行探討。

脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度為3、7、10、13、17、20kV/cm，處理時(shí)間為1000、750、600μs時(shí)不同電場(chǎng)強(qiáng)度不同處理時(shí)間條件下脈沖電場(chǎng)對(duì)荔枝汁中處于穩(wěn)定期(荔枝汁中培養(yǎng)30h)的釀酒酵母滅菌效果見圖2。

圖2 不同電場(chǎng)強(qiáng)度和不同處理時(shí)間對(duì)荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.2 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities and treatment time on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由圖2可以看出，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的升高，釀酒酵母菌數(shù)減少指數(shù)增大。處理時(shí)間延長(zhǎng)，菌數(shù)減少指數(shù)也不斷增大。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為20kV/cm、處理時(shí)間為1000μs時(shí)，PEF處理后釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到4.13。可見，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增強(qiáng)和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PEF對(duì)荔枝汁中的釀酒酵母的滅菌效果更加明顯。

2.3 高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)對(duì)荔枝汁中處于不同生長(zhǎng)期的釀酒酵母的滅菌效果

釀酒酵母處于不同的生長(zhǎng)期對(duì)滅菌效果也會(huì)產(chǎn)生影響，將荔枝汁中培養(yǎng)釀酒酵母5、20、30、35h分別代表釀酒酵母生長(zhǎng)的4個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)研究。由圖3可看出，PEF對(duì)荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母菌數(shù)減少指數(shù)最大，滅菌效果最好。其他3個(gè)時(shí)期滅菌效果依次為對(duì)數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。結(jié)果說明，

圖3 不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)荔枝汁中處于各個(gè)生長(zhǎng)期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.3 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

處于穩(wěn)定期的釀酒酵母對(duì)電場(chǎng)最為敏感。盡管脈沖電場(chǎng)的殺菌機(jī)理目前尚不確定，但其中被大家普遍認(rèn)同的電崩解理論和電穿孔原理均認(rèn)為在外加電場(chǎng)作用下，微生物的細(xì)胞膜發(fā)生了一定的改變，最終導(dǎo)致微生物的死亡[17-19]。釀酒酵母處于穩(wěn)定期時(shí)，由于荔枝汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，各種代謝產(chǎn)物的不斷積累，細(xì)胞膜更容易受到電場(chǎng)的影響，從而使得PEF對(duì)穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果最好。

2.4 高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)不同能量輸入對(duì)處于穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果

圖4 不同電場(chǎng)輸入能量對(duì)荔枝汁中穩(wěn)定期釀酒酵母的滅菌效果Fig.4 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during stable growth phase

通過公式(4)計(jì)算不同的電場(chǎng)強(qiáng)度及處理時(shí)間時(shí)的電場(chǎng)輸入能量，從能量的角度考察PEF對(duì)釀酒酵母的滅菌效果。

由圖4可以看出，隨著電場(chǎng)輸入能量的增加，PEF對(duì)荔枝汁中的穩(wěn)定期釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)不斷增加，滅菌效果越來(lái)越好。通過線性擬合可知，電場(chǎng)輸入的能量和菌數(shù)減少指數(shù)具有一定的線性關(guān)系即y= 0.0018x+2.0482，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9794。當(dāng)輸入的能量由15.16J/mL升至1123.12J/mL時(shí)，PEF對(duì)釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)相應(yīng)由2.15提高到了4.13。

2.5 PEF不同輸入能量對(duì)各生長(zhǎng)期釀酒酵母滅菌效果

圖5 不同電場(chǎng)輸入能量對(duì)荔枝汁中處于各個(gè)生長(zhǎng)期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.5 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

由圖5可以明顯看出，荔枝汁中處于4個(gè)生長(zhǎng)期的釀酒酵母均隨著電場(chǎng)輸入能量的增加菌數(shù)減少指數(shù)增大。處于4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的釀酒酵母對(duì)能量敏感度由強(qiáng)到弱分別是穩(wěn)定期＞對(duì)數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似于2.3節(jié)。

2.6 PEF輸入能量與荔枝汁溫度之間的關(guān)系

處于各個(gè)生長(zhǎng)期的釀酒酵母均隨著能量輸入的增大，滅菌效果增加。但是由于能量輸入增大會(huì)相應(yīng)導(dǎo)致荔枝汁溫度的不斷升高。所以實(shí)驗(yàn)取處理時(shí)間為600μs，以PEF對(duì)穩(wěn)定期釀酒酵母滅菌過程建立輸入能量與荔枝汁樣液溫度的關(guān)系。

表1 高強(qiáng)脈沖電場(chǎng)輸入能量與荔枝汁溫度升高之間的關(guān)系Table 1 Relationship of PEF energy input and temperature in litchi juice

如表1所示， PEF對(duì)荔枝汁的滅菌過程中隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的不斷增加，電場(chǎng)輸入能量不斷增加，荔枝汁溫度升高值也不斷增加。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為20kV/cm時(shí)，溫度升高了30℃，菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到了3.30。雖然處理過程中荔枝汁的溫度升高比起熱處理過程比較小，但是仍可能導(dǎo)致荔枝汁風(fēng)味的改變。所以可以考慮調(diào)整荔枝汁處理時(shí)的流速和電場(chǎng)，如增大電場(chǎng)強(qiáng)度同時(shí)增大處理時(shí)間，或者在一定處理時(shí)間下減小電場(chǎng)強(qiáng)度，達(dá)到要求的滅菌效果。

3 結(jié) 論

PEF對(duì)于荔枝汁中的釀酒酵母具有明顯的殺菌效果。在電場(chǎng)強(qiáng)度為20kV/cm，處理時(shí)間為1000μs，時(shí)釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到4.13。

荔枝汁中處于4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的釀酒酵母對(duì)電場(chǎng)敏感程度不同，由強(qiáng)到弱依次為穩(wěn)定期＞對(duì)數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。可以看出PEF對(duì)荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母殺菌效果最好。

電場(chǎng)強(qiáng)度的增大以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)均使電場(chǎng)輸入的能量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著電場(chǎng)輸入能量的增加，釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)增加，即滅菌效果越來(lái)越好。電場(chǎng)輸入能量的增加導(dǎo)致處理時(shí)荔枝汁溫度的不斷升高。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為20kV/cm處理時(shí)間為600μs時(shí)，溫度升高了30℃，菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到3.30。

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Sterilization Effect of Pulsed Electric Field on Saccharomyces cerevisiae in Litchi Juice

LIU Xin-yu，ZENG Xin-an*，JIA Xiao
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The sterilization effect of pulsed electric field (PEF) treatment on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice was investigated. Results indicated that the lethality of Saccharomyces cerevisiae treated by PEF was increased as the increase of electric field strength and pulsed treatment time. The survival microorganisms exhibited a reduction of 104folds when subjected to the pulsed electric field treatment at 20 kV/min for 1000μs. The sensitivity of PEF treatment during different growth phase of Saccharomyces cerevisiae exhibited an order from strong to weak as stable phase, logarithmic phase, decline phase and adjustment phase. A better sterilization effect of PEF treatment was also observed at the condition of enhanced energy input.

high-intensity pulsed electric field；litchi juice；sterilization

TS255.44

A

1002-6630(2011)03-0091-04

2010-04-29

廣東省國(guó)際合作項(xiàng)目(2009B050400003)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(9151008901000159)

劉新雨(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槊}沖電場(chǎng)對(duì)食品成分的影響。

E-mail：liuxinyu228@yahoo.com.cn

*通信作者：曾新安(1972—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肪G色加工。E-mail：xazeng@scut.edu.cn