桑葉多糖的分離純化及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

羅晶潔，王 尉，曹學(xué)麗

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

桑葉多糖的分離純化及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

羅晶潔，王 尉，曹學(xué)麗*

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

利用Sephadex-G50從桑葉多糖中分離純化得到兩種不同多糖組分MLP1和MLP2，經(jīng)過(guò)高效凝膠色譜(GPC)分析表明，MLP1的純度為94.55%，重均相對(duì)分子質(zhì)量MW為11800，多分散性系數(shù)為1.25，MLP2的純度為96.64%，重均相對(duì)分子質(zhì)量MW為7630，多分散性系數(shù)為1.12。并利用α-葡萄糖苷酶抑制活性體外篩選模型，對(duì)MLP1和MLP2進(jìn)行活性研究，結(jié)果表明兩個(gè)組分對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有較好的抑制活性。

桑葉；多糖；分離純化；高效凝膠色譜；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

桑葉異名鐵扇子，其為桑科植物桑的干燥葉[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，本品性寒、味甘苦，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清肺潤(rùn)燥等功效，可用于風(fēng)熱感冒、頭暈頭痛、肺熱燥咳、目赤昏花[2]；桑葉是傳統(tǒng)的中藥材，含有多種活性成分，如多酚類、黃酮類、甾體類、多糖等[3-4]。國(guó)內(nèi)外研究表明，桑葉在調(diào)控血糖、防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有明顯的功效[5]。有關(guān)專家分析指出：今后一段時(shí)期，研制開(kāi)發(fā)桑葉保健食品具有廣闊的市場(chǎng)。日本科研人員認(rèn)為[6]，桑葉極有可能成為功能性食品原料。目前，我國(guó)科研人員及廠家也在積極合作研制開(kāi)發(fā)桑葉保健品及功能性飲料。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于桑葉多糖的研究大多停留在桑葉多糖的提取和粗分離階段[7-9]，但鑒于桑葉種類的多樣性和多糖結(jié)構(gòu)功能的復(fù)雜性[10-11]，很少有將其分離純化得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的純多糖，并對(duì)純多糖進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究。

本研究采用微波輔助提取的方法，經(jīng)過(guò)脫蛋白、醇沉等粗分離手段得到粗多糖，然后采用凝膠過(guò)濾層析對(duì)桑葉粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，得到兩個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量的桑葉純多糖，并且對(duì)其進(jìn)行α-葡萄糖苷酶的抑制活性的研究，從而為后續(xù)的桑葉多糖結(jié)構(gòu)的表征及構(gòu)效關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉采自北京大興區(qū)植物園。

硫酸、苯酚、TCA試劑、無(wú)水乙醇 北京化工廠；α-葡萄糖苷酶 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖片(拜唐平) 德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒(GOD-POD法) 中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS5微波萃取儀 美國(guó)CEM公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器、玻璃層析柱 上海滬西分析儀器廠；LC-20AD型泵、CTO-20A柱溫箱 日本島津公司；DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測(cè)器、Optilab rex示差檢測(cè)器 美國(guó)Wyatt公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Sephadex G-50 美國(guó)法瑪西亞公司；Shodex SB-806M 高效凝膠色譜柱、Shodex SB-803 高效凝膠色譜柱 日本Shodex公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉多糖的提取

將10g風(fēng)干的桑葉粉碎，過(guò)60目篩，采用微波輔助水提，料液比1:18，提取時(shí)間10min，溫度80℃，合并兩次提取液，過(guò)濾得到桑葉粗提液。再經(jīng)過(guò)TCA法脫蛋白，活性炭脫色，4倍體積醇沉，冷凍干燥得到淺黃色的桑葉粗多糖。

1.3.2 桑葉多糖的純化

將得到的桑葉粗多糖溶于0.1mol/L的NaCl中，利用高效凝膠色譜(GPC)具體測(cè)定各個(gè)峰的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，選取合適的Sephadex凝膠層析介質(zhì)，然后選擇不同的流速和上樣量，確定最佳的純化條件。并采用自動(dòng)部分收集器收集，苯酚硫酸法[12]測(cè)定其多糖含量，繪制洗脫曲線，合并各個(gè)組分。

1.3.3 多糖純度的測(cè)定

根據(jù)洗脫曲線，將合并得到的各個(gè)組分，采用Optilab rex示差檢測(cè)器進(jìn)行純度測(cè)定，并用DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測(cè)器對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定[13-15]。色譜條件：色譜柱：Shodex SB-803，流動(dòng)相：0.1mol/L的NaCl，流速0.5mL/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣體積200μL。

1.3.4 桑葉多糖α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分為空白組、不加抑制劑的陰性組、拜糖平陽(yáng)性組和待測(cè)樣品組。在96孔板中，依次加入如表1所示的各種試劑，于37℃溫育15min，再加入25μL底物溶液(0.5mol/L的蔗糖溶液或0.5mol/L的麥芽糖溶液)，于37℃溫育30min。溫育結(jié)束后，每孔加入150μL 0.1mol/L的Na2CO3中止反應(yīng)。取一定量中止后的反應(yīng)溶液于另一96孔板中，加入200μL葡萄糖測(cè)定試劑盒溶劑，于37℃溫育15min，在酶標(biāo)儀505nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算該抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。當(dāng)抑制率為50%時(shí)，所得抑制劑的濃度，即為該抑制劑對(duì)底物的IC50值。

表1 實(shí)驗(yàn)分組所加試劑Table 1 Reagents in each experimental group

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉多糖的分離純化

2.1.1 凝膠介質(zhì)的選擇

桑葉粗多糖經(jīng)過(guò)0.1mol/L的NaCl的溶解后，進(jìn)行GPC分析，其色譜圖如圖1所示。

圖1 桑葉粗多糖GPC色譜圖Fig.1 GPC chromatogram of the polysaccharides from mulberry leaves

由圖1可知，桑葉粗多糖中，主要存在兩個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量段的組分，保留時(shí)間分別為1 9 m i n和22min。通過(guò)DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測(cè)器對(duì)上述兩個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行一個(gè)大致范圍的確定，其結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量范圍在1000～15000之間。因此，選擇Sephadex G-50凝膠層析介質(zhì)進(jìn)行后續(xù)分離純化。

2.1.2 流速的選擇

選取0.5、0.25、0.1mL/min的流速，利用苯酚硫酸法在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，作洗脫曲線如圖2～4所示。以上3種流速對(duì)比，流速0.1mL/min和0.25mL/min，分離效果均比較理想，但考慮到0.1mL/min，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，因此選擇流速0.25mL/min。

圖2 流速為0.5mL/min時(shí)的洗脫曲線Fig.2 Elution curve at the flow rate of 0.5 mL/min

圖3 流速為0.25mL/min時(shí)的洗脫曲線Fig.3 Elution curve at the flow rate of 0.25 mL/min

圖4 流速為0.1mL/min時(shí)的洗脫曲線Fig.4 Elution curve at the flow rate of 0.1 mL/min

2.1.3 上樣量的選擇

在確定流速0.25mL/min的條件下，選取100、50、25mg 3種上樣量，分別溶于1mL 0.1mol/L的NaCl溶液中，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，作洗脫曲線如圖5～7所示。以上3種質(zhì)量濃度的分離效果對(duì)比，50mg/mL和25mg/mL分離效果較為理想，故選擇50mg上樣量，上樣體積為1mL。

圖5 質(zhì)量濃度100mg/mL時(shí)的洗脫曲線Fig.5 Elution curve at the concentration of 100 mg/mL

圖6 質(zhì)量濃度50mg/mL時(shí)的洗脫曲線Fig.6 Elution curve at the concentration of 50 mg/mL

圖7 質(zhì)量濃度25mg/mL時(shí)的洗脫曲線Fig.7 Elution curve at the concentration of 25 mg/mL

綜上所述，桑葉多糖分離純化的色譜條件為：Sephadex-G50介質(zhì)，0.1mol/L的NaCl溶液溶解，洗脫流速0.25mL/min，上樣量50mg，上樣體積1mL。

2.2 桑葉多糖純度及相對(duì)分子質(zhì)量

取合并后的各個(gè)組分上高效凝膠色譜。利用激光多角度散射檢測(cè)器所得不同角度光強(qiáng)度和相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系，以及示差檢測(cè)器測(cè)得的濃度，進(jìn)行加權(quán)計(jì)算可得重均相對(duì)分子質(zhì)量。其結(jié)果如圖8、9所示。結(jié)果表明：桑葉多糖1號(hào)組分MLP1重均相對(duì)分子質(zhì)量(MW)為11800，純度為94.55%，多分散性系數(shù)為1.25，桑葉多糖2號(hào)組分MLP2重均相對(duì)分子質(zhì)量(MW)為7630。純度為96.64%，多分散性系數(shù)為1.12。

圖8 MLP1 GPC色譜圖Fig.8 GPC chromatogram of MLP1

圖9 MLP2 GPC色譜圖Fig.9 GPC chromatogram of MLP2

2.3 桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2.3.1 陽(yáng)性組拜唐平的α-葡萄糖苷酶抑制活性

將拜唐平分別稀釋為500、100、50、10、1μg/mL，以抑制劑質(zhì)量濃度為橫軸，對(duì)應(yīng)的抑制率為縱軸，繪制抑制IC50抑制曲線。可得對(duì)蔗糖底物拜唐平的IC50=50.32 μg/mL，對(duì)麥芽糖底物拜唐平的IC50=8.28μg/mL。

2.3.2 桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

圖10 桑葉多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲線Fig.10 Inhibitory activity curve of the polysaccharides from mulberry leaves on α-glucosidase

由圖10可知，對(duì)蔗糖底物桑葉粗多糖的IC50= 4.89mg/mL，1號(hào)組分MLP1的IC50=89.1μg/mL，2號(hào)組分MLP2的IC50=70.8μg/mL。經(jīng)過(guò)純化以后，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性大幅提升，提高倍數(shù)分別為55倍和69倍。對(duì)麥芽糖底物的桑葉粗多糖的IC50=7.95mg/mL，1號(hào)組分MLP1的IC50=362μg/mL，2號(hào)組分MLP2的IC50=422μg/mL，可見(jiàn)活性也有大幅的提升，提高倍數(shù)分別為22倍和19倍。

3 結(jié) 論

采用Sephadex-G50介質(zhì)，0.1mol/L的NaCl溶液洗脫，流速0.25mL/min，上樣量50mg，上樣體積1mL，分離純化得到兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量段的桑葉純多糖。MLP1的重均相對(duì)分子質(zhì)量為11800，純度為94.55%，多分散性系數(shù)為1.25，MLP2的重均相對(duì)分子質(zhì)量為7630，純度為96.64%，多分散性系數(shù)為1.12。再通過(guò)體外抑制α-葡萄糖苷酶的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)蔗糖底物的IC50值分別為89.1μg/mL和70.8μg/mL，對(duì)麥芽糖底物的IC50值分別為362μg/mL和422μg/mL，均具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

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Isolation, Purification and Anti-α-Glucosidase Activity of Polysaccharides from Mulberry Leaves

LUO Jing-jie，WANG Wei，CAO Xue-li*
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Two kinds of polysaccharides (MLP1 and MLP2) were isolated and purified from mulberry leaves by Sephadex-G50. The gel permeation chromatographic (GPC) analysis revealed that the purity, relative molecular weight and polydispersity of MLP1 was 94.55%, 11800 and 1.25; Meanwhile, the purity, relative molecular weight and polydispersity of MLP2 was 96.64%, 7630 and 1.12, respectively. Moreover, obvious inhibitory effects of MLP1 and MLP2 on α-glucosidase were observed.

mulberry leaves；polysaccharide；isolation and purification；gel permeation chromatographic (GPC)；α-glucosidase；inhibitory activity

O636.1

A

1002-6630(2011)03-0112-05

2010-06-01

羅晶潔(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：luojingjie268@163.com

*通信作者：曹學(xué)麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x技術(shù)。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn