有機和常規紅提葡萄附生菌的比較分析

劉萬振，武婷婷，生吉萍，申 琳

有機和常規紅提葡萄附生菌的比較分析

劉萬振，武婷婷，生吉萍，申 琳*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

以伊犁金山葡萄莊園的紅提葡萄為原料，通過比較常規葡萄和有機葡萄不同器官表面附生菌群的差異，旨在揭示常規和有機兩種不同栽培模式對葡萄附生菌群的影響。葡萄附生菌的分離、篩選方法為平板培養法，微生物的計數方法為最大或然數法。結果顯示：葡萄根部附生菌的群落總數最大(105CFU/mm2)，莖次之，果實最小(約102CFU/mm2)。在果實上，有機葡萄附生真菌種類多于常規葡萄，而附生細菌種類與之相反。除葡萄葉沒有顯著差異外，有機葡萄各器官(根、莖、果實)附生菌菌落總數均大于常規葡萄。初步表明，有機栽培可以更好地保持生態環境中微生物群落的生物多樣性。

紅提葡萄；有機食品；附生菌；食品安全

紅提葡萄又名紅地球葡萄，原產于美國，是美國加利福尼亞州立大學研究人員通過雜交實驗培育而成的一個葡萄品種。自1986年引入該品種以來[1]，紅提葡萄的種植在我國北方得到了大力推廣。新疆伊犁地區深居內陸，受高山阻隔，海洋濕氣很難進入，年平均降雨量較少。由于日照時間較長(年日照時間可達3000h左右)，葡萄光合作用積累的有機物多；較大的晝夜溫差(9月份可高達17℃)又降低了葡萄夜間的呼吸作用強度，減少了有機物的消耗。所以在近乎天然的廣袤的新疆大地上種植葡萄，無論在產量還是在質量上，都走在了全國前列[2]。

隨著人們生活水平的提高，公眾倡導的“天然、營養、健康”的消費理念正在推動著食品工業朝著綠色、有機食品的方向快速發展。目前國內葡萄以常規葡萄栽培為主，有機葡萄栽培悄然興起。與常規栽培模式相比，有機栽培模式下的葡萄管理成本升高、單產降低，其單價高出常規葡萄數倍之多，但是由于沒有農藥殘留，有機葡萄深受廣大消費者，尤其是高收入群體的青睞。

植物附生菌(epiphyte)是一類附著在植物表面、以植物分泌物為營養的微生物類群。植物附生菌菌群復雜多樣，在植物抗病、生長等過程中起著重要的作用。因生長在植物的表面，植物附生菌菌群的結構和數量易受地勢、空氣溫度、濕度、空氣流動、陽光等因素影響[3]；施肥、噴灑農藥，也能影響附生菌的群落結構。

作為一種漿果類水果，葡萄在貯運過程中容易擠壓擦傷，進而滋生腐敗微生物，導致大面積腐爛。常見的葡萄病害包括白腐病、灰霉、霜霉病、白粉病等[4]。抑制采后葡萄病原菌生長、延長葡萄貯藏期一直是一個難點問題。以有機和常規紅提葡萄為實驗材料，研究葡萄各器官附生菌之間的關系、尤其是常規和有機葡萄之間附生菌在數量上的差異，探討葡萄采后病害問題，可為采后葡萄貯藏保鮮提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

常規和有機紅提葡萄根、莖、葉、果實，均采自新疆伊犁霍城縣金山葡萄莊園(兩實驗材料選自同一地理環境，可排除自然環境的影響)。

1.2 培養基

營養瓊脂(N)(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(P)(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，自然pH值)；酵母菌培養基(Y)(葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂粉20g、蒸餾水1000mL，自然pH值)；高氏1號培養基(F)(可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6)，以上培養基均在121℃濕熱滅菌20min后使用[5]。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KB高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；YT-CJ-2DN潔凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發中心；VORTEX-5混勻器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SHP-450生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱 青島海爾醫用低溫科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣方法

為防止樣品水分蒸發，早晨9點左右開始采樣。

葡萄果實：手戴一次性無菌手套，選取果穗均勻、無病蟲害和機械傷的果穗，小心剪下，并迅速裝進無菌采樣袋，4℃保存。

葡萄莖、葉：手戴一次性無菌手套，隨機選取無病蟲害的莖、葉，小心剪下后迅速裝進無菌采樣袋，4℃保存。

葡萄根：手戴一次性無菌手套，剪取不同年齡段的根，迅速裝進無菌采樣袋，4℃保存。

1.4.2 葡萄器官附生菌的計數方法

隨機挑取規則的葡萄器官(葡萄果實以球體為模型、根和莖以圓柱體為模型、葉剪成長方形)，每種器官取3份，分別測量其表面積；然后將其放入盛有75mL無菌水的三角瓶中，用封口膜扎好；將三角瓶移至170r/min的搖床中振搖1h；迅速將葡萄器官轉移至另一個盛有無菌水的三角瓶中，重復振搖3次，3次振搖后的菌液分別按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀釋，并分別平板涂布，重復3次；然后置于30℃培養箱中培養2d，按照最大或然數(must probable number，MPN)法計數。附生菌總數以前三次振搖后之和計。

1.4.3 葡萄器官附生菌種類計數方法

根據菌落形態差異，分別挑取各葡萄器官附生菌，并進行純化，然后分別統計從不同器官分離的菌落形態不同的附生菌的種類。

1.4.4 統計學分析方法

用Origin 8.0軟件對所得到的數據進行方差分析和鄧肯檢驗，選取的顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 在不同培養基上有機和常規葡萄葉附生菌菌落總數比較

圖1 有機和常規葡萄葉附生菌菌落總數比較Fig.1 Comparison of leaf epiphyte number between organic and common grapes

由圖1可知，P培養基培養時，有機葡萄葉的菌落總數為120CFU/mm2，有機葡萄葉附生真菌菌落總數是常規葡萄葉的1.89倍，差異顯著(P＜0.05)。N培養基培養時，有機葡萄葉的菌落總數為947CFU/mm2，是常規葡萄葉的1.25倍，差異顯著(P＜0.05)。在Y和F培養基上培養時，常規葡萄葉和有機葡萄葉附生菌的菌落總數差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 在不同培養基上有機和常規葡萄果實附生菌菌落總數比較

圖2 有機和常規葡萄果實附生菌菌落總數比較Fig.2 Comparison of fruit epiphyte number between organic and common grapes

由圖2可知，在不同培養基上培養，有機葡萄果實附生菌菌落總數和常規葡萄果實附生菌差異顯著(P＜0.05)。P培養基培養時，有機葡萄果實附生菌的菌落總數為34CFU/mm2，是常規葡萄果實的1.97倍。N培養基培養時，有機葡萄果實的菌落總數為532CFU/mm2，是常規葡萄的1.60倍。F培養基培養時，有機葡萄果實的菌落總數為351CFU/mm2，是常規葡萄果實的2.60倍。在Y培養基上培養時，有機葡萄果實為54CFU/mm2，是常規葡萄的2.87倍。有機葡萄果實附生菌菌落總數顯著大于常規葡萄。

2.3 不同葡萄器官的附生菌菌落總數比較

表1 不同器官附生菌菌落總數比較Table 1 Comparison of epiphyte number on different organs of organic and common grapes

由表1可知，有機和常規葡萄相比，除葡萄葉外，葡萄根、莖、果實的附生菌菌落總數差異顯著(P＜0.05)，有機葡萄的根、莖、果實附生菌菌落總數均大于常規葡萄，其中根部差異最大，有機葡萄根部附生菌為常規葡萄的6.73倍。葡萄果實和葡萄葉附生菌菌落總數較少，推測附生菌的菌落總數可能與器官表面的粗糙程度有關。器官越粗糙，比表面積越大，微生物越容易黏附和滋生。而葡萄根附生菌菌落總數是其他器官的數十倍，分析可能是根圍微生物大量黏附在根表面的原因。噴灑農藥和施用化肥，會影響微生物的正常生命活動[3-5]，這也是造成有機葡萄器官附生菌數量大于常規葡萄的重要原因。

圖3 不同葡萄器官附生細菌種類比較Fig.3 Comparison of epiphyte bacterial species on different organs of organic and common grapes

圖4 葡萄器官附生真菌種類Fig.4 Comparison of the numbers of epiphyte fungi species on different organs of organic and common grapes

圖5 有機葡萄和常規葡萄附生菌種類比較Fig.5 Comparisons of the number of epiphyte fungi and bacterial species on different organs of organic and common grapes

由圖3可知，有機葡萄莖和葡萄根附生細菌的種類少于常規葡萄，而有機葡萄果實和葡萄葉附生細菌種類多于常規葡萄。圖4說明，有機葡萄果實和葡萄根附生真菌的種類多于常規葡萄。圖3、4顯示，常規葡萄莖附生細菌種類最多，達15種，常規葡萄根次之，為14種，常規葡萄果實最少，僅為5種；在有機葡萄器官中，附生細菌的種類由葡萄根、葡萄莖、葡萄葉和葡萄果實呈遞減趨勢。與之相反，附生真菌種類最多的是有機葡萄果實，其在常規葡萄果實表面的種類為6種，在葡萄莖和根部較少。由此推測，附生菌種類除與器官粗糙程度有關外，也可能與器官表面的微環境有關。附生菌在植物器官表面營寄生生活，而各器官表面不盡相同的分泌物，對微生物起到一定的選擇和富集作用，進而影響附生微生物的種群分布[3]。圖5表明，有機葡萄附生真菌種類多于常規葡萄，而細菌種類比常規葡萄少。

3 討 論

植物的根、莖、葉、果實等表面，黏附著大量的細菌[6]、真菌[7]、古菌等附生菌[3]，這些附生菌可以通過水平基因轉移[8]、和植物互惠共生[9-10]、轉變成內生菌、轉變成植物病原菌或者成為植物腐生菌等方式與植物相互作用[3]。

葡萄樣品采自于伊犁霍城縣金山葡萄莊園，由于處于同一環境，排除了氣候等外界條件的干擾。有機葡萄器官附生菌群落總數大于常規葡萄，附生真菌種類較多，細菌種類略少于常規葡萄，微生物種類與微生物群落總數之間無相關關系。Granado等[9]研究金冠蘋果在有機農業體系(organic farming system)和復合農業體系(integrated farming system)下附生菌之間的關系時發現，有機蘋果附生真菌包括22個類群，高于非有機模式下的真菌類群數。此外，葡萄的栽培方式可能影響器官附生菌群的變化，施肥和噴灑農藥對微生物種群結構及數量影響較大[3,9]。

附生菌通過產生胞外分泌物，在器官表面形成一種生物膜，黏合在植物器官表面。附生菌的這種生存方式，既可以防止菌體水分過多蒸發[3]，又增強了其對農藥的抵抗能力[11]。無論有機葡萄還是常規葡萄，葡萄果實附生菌的群落總數都最小，葡萄根表面的微生物群落總數最多，根部的附生菌遠遠大于其他器官。附生細菌種類最少的葡萄果實，真菌種類卻最多，說明微生物種類可能與器官表面的微環境和器官的外滲物質類型有關[8]。

張學君[12]研究發現，蘋果附生菌中存在著多種對蘋果常見病癥——輪紋病和炭疽病起拮抗作用的微生物。有機栽培的蘋果表面附生的絲狀真菌的類群和數量均比非有機栽培的蘋果豐富，推測可能與栽培模式有關，豐富的附生真菌可能會抑制蘋果病原菌，利于病害的防治[9]。附生菌可以通過營養競爭、占位效應、產生抑菌物質等方式抑制表面病原菌的繁殖，而常規栽培模式中的噴灑農藥和施用化肥等，會改變附生菌原始的群落組成，打破其群落平衡，在采摘之后，這種群落的不平衡可能會導致果實的過早腐爛。

[1]趙勝建. 紅地球葡萄國內外栽培現狀及特點[J]. 北方園藝, 1998(5): 30-31.

[2]生吉萍, 申琳, 吳文良, 等. 伊犁地區綠色-有機葡萄保鮮儲運關鍵技術問題與對策[J]. 新疆農業科學, 2008(增刊3): 97-100.

[3]ANDREWS J H, HARRIS R F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces[J]. Annual Review of Phytopathology, 2000, 38: 145-180.

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[6]YRJA K, MANCANO G, FORTELIUS C, et al. The incidence of Burkholderia in epiphytic and endophytic bacterial cenoses in hybrid aspen grown on sandy peat[J]. Boreal Environment Research, 2010, 15 (1): 81-96.

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[9]GRANADO J, THURIG B, KIEFFER E, et al. Culturable fungi of stored , golden delicioupple fruits: a one-season comparison study of organic and integrated production systems in Switzerland[J]. Microbial Ecology, 2008, 56(4): 720-732.

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[11]COSTERTON J W, STEWART P S, GREENBERG E P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections[J]. Science, 1999, 284: 1318-1322.

[12]張學君, 徐盈, 王建營. 蘋果表面微生物數量及其與兩種主要病菌的關系[J]. 果樹科學, 1995, 12(4): 232-236.

Comparative Analysis of Epiphyte between Organic and Common Red Globe Grapes

LIU Wan-zhen，WU Ting-ting，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Both organic and conventional red globe grape were sampled from Jinshan vineyard in Yili. The effect of different farming models of conventional and organic farming models on the epiphyte distribution was studied preliminarily in current paper by comparing the epiphytic biodiversity in grape organs. The agar-plate culture method was used for the microbial isolation, and the most-probable-number (MPN) was used for the enumeration of epiphyte population. The result was as follows: the largest number of epiphytes located on the root (up to 105CFU/mm2), and the stem took second place, and the smallest on fruit (about 102CFU/mm2). Besides, the amount of epiphytic fungi species of the organic grape was slightly higher than that of conventional grape; on the contrary, the amount of epiphytic bacteria species of the organic grape was lower. The number of epiphytic microorganisms of organic grape was more than that of conventional grape on all organs except leaf. The organic farming was shown to be more effective to keep the biodiversity of microbial communities in ecological environment.

red globe grape；organic food；epiphyte；food safety

TS201.3

A

1002-6630(2011)03-0126-04

2008-08-08

國家自然科學基金項目(30972065；30671471)；國家公益性行業(農業)科技項目(200803033)；

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD22B07-01；2007BAC15B05-04；2008BADAIB07)

劉萬振(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：liuwanzhen123@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農副產品綜合利用。E-mail：shen5000@gmail.com