利用來源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突變體Y89D制備α-環糊精

王 寧，吳 丹，陳 晟，陳 堅，吳 敬,*

利用來源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突變體Y89D制備α-環糊精

王 寧1,2，吳 丹1,2，陳 晟1,2，陳 堅1,2，吳 敬1,2,*

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；
2.江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

對α-環糊精葡萄糖基轉移酶(α-CGTase)突變體Y89D制備α-環糊精的影響因素進行初步研究。其因素包括淀粉種類(馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉)、加酶量、反應時間、pH值、有機溶劑(乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇)和溫度。結果表明：選用5g/100mL馬鈴薯淀粉、pH5.0、溫度30℃、加酶量控制在每克淀粉5U左右，反應體系中加入體積分數5%的正癸醇，反應6h后，淀粉總轉化率可達70%，其中α-環糊精在產物中質量分數約為85%，轉化產物中含有少量β-環糊精(15%)，而極少生成γ-環糊精。因此，α-CGTase突變體Y89D在制備α-環糊精工藝中具有很好的工業化應用前景。

α-環糊精；α-環糊精葡萄糖基轉移酶；有機溶劑；轉化率

環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase，EC2.4.1.19)是α-淀粉酶家族的重要成員，其獨特功能是能將淀粉轉化為環糊精[1]。環糊精是由6個以上葡萄糖連結而成的具有環狀疏水圓錐形結構的低聚糖非還原性化合物系列，其中最常用的是α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精，它們分別由6、7、8個葡萄糖單元構成[2]。環糊精分子的內表面呈疏水性，外表面呈親水性，這種獨特的分子結構使它可以通過范德華力、疏水作用力等與一些疏水性客體分子或基團形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩定性等，因此其在食品、醫藥、農業、紡織、環保、化妝品、生物技術和分析化學等領域具有廣泛的應用[3-5]。3種常用的環糊精中，由于β-環糊精溶解度最小，可以很方便地通過分步結晶的方法制得，因此，目前工業生產中大量制備和廣泛應用的是β-環糊精，但是β-環糊精無法取代α-環糊精的用途，相比于β-環糊精，α-環糊精具有更小的空腔，更適于包合具有低分子質量的分子，并且是一種非常好的膳食纖維，在食品等領域已顯示出無可比擬的優勢。雖然市場上對α-環糊精有較大的需求，但由于CGTase的產物特異性差，而且α-環糊精的水溶性相對較高，不容易分離純化，因此造成生產成本高，α-環糊精價格昂貴。國外雖然已有相關研究報道，但是產量非常有限，國內尚未見α-環糊精生產工藝的報道，因此研究α-環糊精的酶轉化與制備工藝顯得至關重要。

生產α-環糊精的方法主要有化學法和生物法，化學法是將馬賽蘭氏淀粉與四氯乙烷反應，生成α-環糊精粗品，再經過濾和水蒸氣蒸餾后得到純度相對較高的α-環糊精[6]。由于α-環糊精溶解度較大，所以化學法制備比較困難，而且會對環境造成較大污染。生物法目前被認為是極具應用潛力的方法。然而關于生物法生產α-環糊精的報道則很少。陳龍然等[7]從土壤中分離出一株地衣芽孢桿菌，該菌發酵得到的CGTase作用于淀粉后，產物以α-環糊精為主，β-環糊精次之，二者比例為 2.47:1，環糊精總產率為29.8%。王俊英等[8]從其實驗室保存的一株Bacillus sp. 60221細菌中純化了一種α-CGTase，利用該酶轉化淀粉24h，總轉化率可達41%，其中α-環糊精占總轉化產物的78%。

目前，所有已知的野生型CGTase生產的均是α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精的混合物，這給產物的分離純化帶來很大不便，因此如何提高環糊精生產的特異性成為了近幾年研究的熱點。研究表明，通過一些定點突變的設計，對CGTase活性中心底物結合凹槽附近的一個或多個重要的氨基酸殘基進行取代、插入或者刪除等會改變CGTase產物中α、β、γ構型的比例，從而改善環糊精的產品特異性，并減弱產物抑制[9-11]。

根據文獻報道，CGTase的一級結構是決定產物特異性的主要內在因素，CGTase活性中心凹槽至少包括9個糖結合位點[12]，在環化過程中，葡萄糖殘基在亞位點-3上的結合模式發生改變，最近的一些定點突變結果證實了與定位在亞位點-3上的葡萄糖殘基有相互作用的氨基酸殘基對CGTase的產物特異性具有重要的作用[13]。氨基酸殘基89 (按照Peanibacillus macerans CGTase編號)是亞位點-3的組成部分，因此在前期研究中，本實驗室選擇Peanibacillus macerans JFB05-01 CGTase中的Tyr89作為定點突變的目標，將Peanibacillus macerans JFB05-01 CGTase中位于亞位點-3處89位的酪氨酸(Y)突變成天冬氨酸(D)，發現該突變體可以顯著提高α-環糊精特異性[14]。本實驗對α-CGTase突變體Y89D制備α-環糊精的影響因素進行初步研究，從而為α-環糊精的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌cgt/pET-20b(+)/E.coli BL21(DE3)由本實驗室構建并保存[15]；大腸桿菌cgt-Y89D/pET-20b(+)/ E.coli BL21(DE3) 由本實驗室構建并保存[14]。

α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精 Sigma-Aldrich (上海)公司；玉米淀粉 諸城興貿玉米開發有限公司；馬鈴薯淀粉 寧夏固原六盤山淀粉公司；木薯淀粉 廣西武鳴淀粉廠；乙腈(色譜純) 美國Honeywell公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7200型分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；冷凍立式離心機CF16RX 日本Hitachi公司；高速離心機 德國Eppendorf公司； W201D電熱恒溫水浴搖床 江蘇金壇國華儀器廠；Waters 600HPLC色譜儀、Waters自動進樣器、Waters2410示差檢測器 美國Waters公司；色譜柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)德國Merch公司。

1.3 方法

1.3.1 野生α-CGTase及α-CGTase突變體Y89D粗酶液的制備

種子培養：將保藏的菌種接入裝有50mL LB培養基的250mL三角瓶中，回旋式搖床轉速200r/min，培養溫度為37℃，培養8h。

發酵培養：將培養好的種子培養液按體積分數4%的接種量，接種至裝有100mL TB培養基的500mL三角瓶中進行發酵培養，搖床轉速200r/min，培養溫度為25℃，培養4d。各培養基使用前添加100μg/mL氨芐青霉素。將發酵液于4℃、10000r/min離心20min 除菌體，收集上清液，上清液即為粗酶液。

1.3.2 α-CGTase活力的測定

甲基橙法測定酶環化活力。將適當稀釋的粗酶液加入裝有預先用50mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)配制1g/100mL可溶性淀粉溶液的試管中，在40℃反應10min后，加入1.0mL 1.0mol/L的鹽酸停止反應，再加入1.0mL用50mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1mmol/L甲基橙，在20℃保溫20min，在波長505nm處測定吸光度。酶活單位(U)定義為在上述條件下每分鐘生成1μmol的α-環糊精所需的酶量。

1.3.3 HPLC法測定環糊精產量

采用HPLC法進行酶產物分析。用磷酸鹽緩沖溶液配制5g/100mL淀粉溶液，沸水浴中加熱糊化10min，冷卻至反應溫度后添加一定量的α-CGTase和有機溶劑，充分混勻后在40℃、200r/min水浴搖床中反應24h，相隔一定時間取樣500μL，加熱滅酶后于12000r/min離心25min，上清液經0.45μm超濾膜過濾后取10μL上機分析。

采用HPLC進行產物分析的色譜條件為：Waters 6 0 0 H P L C色譜儀、W a t e r s自動進樣器、色譜柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)；Waters2410示差檢測器；流動相為65%乙腈水溶液，流速1mL/min；柱溫3 0℃。

1.3.4 α-CGTase突變體Y89D作用淀粉生產α-環糊精的影響

1.3.4.1 淀粉種類對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

參照1.3.3節方法分別以可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉作為原料制備α-環糊精，HPLC檢測分析環糊精產量。

1.3.4.2 加酶量對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

配制pH6.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液，每克淀粉分別加入2.5、5、10、20、30、40U的CGTase粗酶液，參照1.3.3節制備α-環糊精，HPLC檢測分析環糊精產量。

1.3.4.3 溫度對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

參照1.3.3節方法配制pH6.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液，加酶量控制在每克淀粉5U左右，反應6h，分別在不同的溫度條件下制備α-環糊精，HPLC檢測分析環糊精產量。

1.3.4.4 pH值對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

參照1.3.3節方法用不同pH值緩沖溶液配制5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液，控制加酶量為每克淀粉5U，于30℃進行轉化反應，HPLC檢測分析環糊精產量。

1.3.4.5 有機溶劑對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響[16]

配制pH5.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液，加酶量控制在每克淀粉5U，反應體系中分別加入2%的乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇，反應溫度30℃，參照1.3.3節方法制備α-環糊精，HPLC檢測分析環糊精產量。

1.3.4.6 正癸醇添加量對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

配制pH5.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液，反應體系中分別加入體積分數1%、2%、5%、7.5%、10%的正癸醇，加酶量控制在每克淀粉5U，反應溫度30℃，反應6h，反應結束后水蒸氣蒸餾[17]除去正癸醇，參照1.3.3節方法制備α-環糊精，HPLC檢測分析環糊精產量。

2 結果與分析

2.1 野生酶與α-CGT酶突變體Y89D生產環糊精的比較

圖1 野生酶與α-CGTase突變體Y89D生產環糊精的比較Fig.1 Comparison of α-cyclodextrin production between the wide-type α-CGTase and mutation Y89D of α-CGTase

從圖1可見，對于野生CGTase，在反應起始階段，α-環糊精是主要產物，而只生產少量的β-環糊精、γ-環糊精；反應8h，β-環糊精的質量濃度已經開始超過α-環糊精的質量濃度，隨著反應時間的延長，α-環糊精占總環糊精產物的比例降低，β-環糊精比例增加，反應24h時，β-環糊精的產量明顯大于α-環糊精的產量，產物中α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精質量比為44.4:53:2.6。與野生酶相比，α-CGT酶突變體Y89D能提高α-環糊精的生產能力，降低β-環糊精的生產能力，在反應的起始階段，α-環糊精仍然是主要產物，而β-環糊精的生成速率與野生酶相比明顯降低，反應4h，α-環糊精的質量濃度達到最高，隨后α-環糊精的質量濃度逐漸降低，β-環糊精的比例逐漸增加，但是增加幅度非常緩慢，反應6h，α-環糊精的質量濃度大約是野生CGTase的1.2倍，而β-環糊精的質量濃度下降到野生CGTase的89%，反應24h后，產物中幾乎有等量的α-環糊精和β-環糊精，α-環糊精和β-環糊精比例為52:48，而沒有檢測到γ-環糊精。這說明突變體Y89D比野生酶更適合α-環糊精的工業化生產。由于本實驗中，反應4～6h，體系中α-環糊精的質量濃度最高，因此生產時控制反應時間在4～6h，不僅可以獲得較高的α-環糊精產量還可以減少反應時間而降低生產成本。

2.2 淀粉種類對α-CGTsae突變體Y89D生產α-環糊精的影響

從表1可見，CGTase作用于淀粉后所產生的α-環糊精和β-環糊精量及總的環糊精產率在不同淀粉類型之間有所不同。4種淀粉生產環糊精的總轉化率中馬鈴薯淀粉最高為35.07%，木薯淀粉、可溶性淀粉和玉米淀粉分別為32.53%，32.14%和25.81%；4種淀粉中，可溶性淀粉生成的α-環糊精的比例最高，其次為馬鈴薯淀粉。由于環糊精生產中通常采用淀粉作為原料，淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，不同類型的淀粉具有不同的直鏈與支鏈比例，這些結構上的差異，對環糊精的生產有很大的影響，有研究表明[18-19]支鏈淀粉含量高的淀粉生產環糊精的產率較高，這可能是因為支鏈淀粉只能被淀粉酶部分水解為麥芽糖，而直鏈淀粉可以被淀粉酶完全水解為麥芽糖，而CGTase本身屬于淀粉酶家族的一員，它可以水解淀粉，麥芽糖是小分子糖，它的存在有利于CGTase將環糊精的環打開，從而對環糊精的生成有抑制作用[7]，所以支鏈淀粉含量很高的馬鈴薯淀粉就有利于環糊精的生產，這與本實驗的結果一致。考慮到工業化生產以及后期提取的成本因素，由于可溶性淀粉的價格較昂貴，因此綜上分析，選用馬鈴薯淀粉生產α-環糊精不僅可以降低成本還可以獲得高淀粉轉化率。

表1 淀粉種類對α-環糊精生產的影響Table 1 Effect of starch type on α-cyclodextrin production

2.3 加酶量對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

圖2 加酶量對α-環糊精生產的影響Fig.2 Effect of enzyme amount onα-cyclodextrin production

從圖2可以看出，α-環糊精的產量隨著加酶量的增加先上升后下降，當加酶量達到5～10U/g時，α-環糊精的產量最高，隨著加酶量的繼續增加，α-環糊精的產量一直下降，而β-環糊精的產量隨著加酶量的增加一直上升，加酶量越大，越有利于β-環糊精的生成(數據未列出)。

CGTase是一種多功能型酶，它能催化4種不同的反應：環化反應、偶合反應、歧化反應和水解反應，這4種反應的機理基本相同，僅僅是受體分子不同[7]。1)環化反應：它是CGTase的特征反應，α-(1→4)葡聚糖分子通過分子內糖基轉移反應生成環糊精，反應一般從α-(1→4)葡聚糖的非還原性末端開始；2)偶合反應：偶合反應是環化反應的逆反應，它可以將環糊精的環打開，然后轉移到葡萄糖和麥芽糖等受體上，其中二糖被認為是最為有效的受體糖，這個反應一般發生在轉化后期，這可以解釋在淀粉轉化為環糊精的過程中，隨著反應時間延長產物由α-環糊精向β-環糊精轉變的現象，在反應體系中存在高濃度麥芽低聚糖或葡萄糖的情況下容易發生偶合反應[1]；3)歧化反應：直鏈寡糖分子間進行糖基轉移的作用，生成重合度不同的各種糖分子，如果底物是淀粉，主要發生在CGTase催化反應的初始階段，表現為糊化液黏度快速下降；4)水解作用：即CGTase可以在一定程度上催化環糊精的分解。本實驗中隨著加酶量的增加，相應CGTase的歧化、偶合反應能力也隨著增強，反應體系中的小分子糖濃度增加，高濃度小分子糖的存在更有利于發生偶合反應，從而將生成的α-環糊精的環打開，然后轉移到小分子糖受體上生成β-環糊精。因此在生產中要控制好CGTase的添加量，尤其是生產α-環糊精時，使加酶量保持在 5～10U/g的范圍內，不僅可以提高α-環糊精的產量還可以降低生產成本。

2.4 溫度對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

表2 溫度對α-環糊精生產的影響Table 2 Effect of temperature on α-cyclodextrin production

從表2可以看出，溫度對α-糊精產率影響作用比較顯著，30℃時，淀粉總轉化率最高可達到39%，其中α構型與β構型質量比為65:35，隨著溫度的繼續升高，淀粉總轉化率逐漸降低，且α-環糊精在環糊精中的比例也逐漸下降，說明溫度越低越有利于α-環糊精的生成。

酶是一種蛋白質，蛋白質一級結構中的氨基酸序列與生物功能密切相關，一級結構的變化往往導致蛋白質生物功能的變化。α-CGTase突變體Y89D相比于野生酶，其一級結構的改變可能會使該酶的熱穩定性有所降低，因此低溫條件更有利于該酶合成α-環糊精；同時在高溫條件下，CGTase的天然構象可能被破壞，酶分子變性失活，所以造成淀粉轉化率降低。因此本實驗選用30℃作為生產α-環糊精的反應溫度。

2.5 pH值對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

圖3 pH值對α-環糊精生產的影響Fig.3 Effect of pH on α-cyclodextrin production

從圖3可以看出，α-CGTase突變體Y89D轉化淀粉生成α-環糊精的最適pH值為5.0。pH5.0時，反應6h，Y89D突變體轉化淀粉生成的α-環糊精產量最高達到13.5g/L，明顯高于其他pH值條件下α-環糊精的產量。隨著pH值的繼續升高，在pH6.0～8.0范圍內，α-環糊精的產量及合成速率相比于pH5.0時都有所下降。當pH值降低到4.0時，α-環糊精的產量最低。pH值之所以對酶催化有很大影響，從酶反應動力學的角度看，很可能是因為它改變了酶活性部位有關基團的解離狀態。在最適pH值時，酶分子上活性基團的解離狀態最適于酶與底物的結合；而高于或低于最適pH值時，酶活性部位基團解離狀態不利于酶與底物的結合，酶活力也相應降低，因此淀粉轉化率也很低。另外，pH值除了對酶活性有很大影響外，對酶的穩定性也有很大影響。過高過低的pH值會改變酶的活性中心的構象，甚至改變整個酶分子的結構使其變性失活。因此本實驗選用pH5.0作為α-環糊精生產的條件。

2.6 有機溶劑對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

圖4 有機溶劑對α-環糊精生產的影響Fig.4 Effect of organic solvent on α-cyclodextrin production

有文獻報道[20-22]，向反應體系中添加有機溶劑可以提高環糊精的生成量，本實驗考察了乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇對α-環糊精生產的影響，結果如圖4所示。

由圖4可見，所有有機溶劑都能提高α-環糊精的產量，乙醇和異丙醇對α-環糊精產量的提高不是很明顯，而添加正丁醇和正癸醇能顯著提高α-環糊精的產量，但是從反應時間看，正癸醇比正丁醇更有利于α-環糊精的生產。添加正癸醇反應6h，α-環糊精的產量即可達到26.5g/L，是未添加有機溶劑時的2倍，此時淀粉的轉化率最高達到了60%，是對照組的1.4倍，其中α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精質量比為83:17:0；而添加正丁醇反應8h，α-環糊精的產量才可達到25.7g/L，此時淀粉的轉化率最高只有5 9%，其中α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精質量比為79:20:1，因此正癸醇更有利于α-環糊精的生產。

不溶性的有機溶劑如正癸醇能提高環糊精的產量一方面是因為有機溶劑能與生成的環糊精形成不溶性絡合物，經過沉淀，連續從反應系統中去除環糊精，改變反應的平衡，使其向著環糊精的生成方向不斷進行，有利于環糊精生產；另一方面，環糊精與有機溶劑形成包絡物的同時，也解除了環糊精本身的產物抑制，因此反應能不斷的進行[17]。對于可溶性的有機溶劑如乙醇、正丁醇等能提高環糊精的轉化率也是因為它們能與環糊精形成絡合物，但是這些絡合物溶于水，為α-環糊精的后期提取造成困難。考慮到工業化生產以及后期提取成本的因素，綜上分析，本實驗選用正癸醇作為生產α-環糊精的有機溶劑。

2.7 正癸醇添加量對α-CGTase突變體Y89D生產α-環糊精的影響

表3 正癸醇添加量對α-環糊精生產的影響Table 3 Effect of n-decanol amount on α-cyclodextrin production

由表3可見，淀粉總轉化率隨著正癸醇體積分數的增加先升高后降低，正癸醇體積分數為5%時，反應6h，淀粉總轉化率即可達到70%，其中α構型與β構型質量比為85:15，α-環糊精的產量可達到2.76g(體系中總淀粉量為5g)。隨著正癸醇體積分數的繼續增加，淀粉總轉化率反而降低，分析原因可能是因為體系中高濃度的有機溶劑會影響CGTase的穩定性，從而影響淀粉的轉化率。 因此綜上分析，本實驗選用體積分數5%的正癸醇生產α-環糊精。

3 結 論

隨著環糊精的應用越來越廣泛，對α-環糊精的需求越來越大，因此迫切需要研究α-環糊精的酶轉化與制備工藝，國內尚未見相關工藝的報道。本實驗研究了利用α-CGTase突變體Y89D制備α-環糊精的工藝。結果表明：選用5g/100mL馬鈴薯淀粉、pH5.0、溫度30℃、加酶量控制在5U/g左右，反應體系中加入體積分數5%的正癸醇，反應時間6h，可獲得70%的淀粉總轉化率，其中α-環糊精在產物中約占85%，轉化產物中只含有少量β-環糊精(15%)，而極少生成γ-環糊精，高于國內報道的最高轉化率與比例[7-8]。這說明該突變體非常適合α-環糊精的工業化生產，具有廣闊的實際應用前景。同時該工藝流程簡單，生產周期短，反應6h即可獲得較高的α-環糊精轉化率，并且降低了α-環糊精的生產成本，這為利用該突變體工業化生產α-環糊精的后續研究奠定了良好的基礎。

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Preparation ofα-Cyclodextrin by Mutation Y89D of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Paenibacillus macerans

WANG Ning1,2，WU Dan1,2，CHEN Sheng1,2，CHEN Jian1,2，WU Jing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The factors for preparingα-cyclodextrin by mutation Y89D of α-cyclodextrin glycosyltransferase (α-CGTase) were investigated. The factors include starch types (potato, corn, cassava and soluble starch), enzyme amount, reaction time, pH, organic solvents (ethanol, isopropanol, n-butanol and n-decanol) and temperature. Results indicated that the optimal conditions were 5 g/100 mL potato starch, 5 U/g CGTase, pH 5.0, 30 ℃, 5% n-decanol and reaction time of 6 h. Under the optimal conditions, 70% conversion rate of starch to cyclodextrins was achieved, which included 85% α-cyclodextrin, 15% β-cyclodextrin and trace γ-cyclodextrin. Therefore, the mutation Y89D of α-CGTase has promising industrial application prospect.

α-cyclodextrin；α-cyclodextrin glycosyltransferase；organic solvent；conversion rate

Q814.9；TS202

A

1002-6630(2011)03-0165-06

2010-04-29

國家杰出青年基金項目(20625619)；食品科學與技術國家重點實驗室科研基金項目(SKLF-MB-200802)；國家“973”項目(2007CB 714036)

王寧(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為工業酶技術。E-mail：wangwang-115566@163.com

*通信作者：吳敬(1969—)，女，教授，博士，研究方向為基因工程和分子酶學工程。E-mail：jingwu80@hotmail.com