黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及部分性質研究

蘇 茉，高亞朋，梁建榮，黃 潔，唐云明

黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及部分性質研究

蘇 茉，高亞朋，梁建榮，黃 潔，唐云明*

(西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715)

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b菌絲體，經pH5.7磷酸緩沖液抽提獲得粗酶液，粗酶液經DEAE-Sepharose離子交換層析和Superdex-200凝膠過濾層析，得到葡萄糖氧化酶純品。該酶的比活力為30569.7U/mg，回收率為30.2%，提純倍數為41.4倍，分子質量為94.1kD，為單亞基酶。該酶最適溫度為37℃，最適pH值為5.7，在30～40℃溫度范圍內穩定性較好，在pH4.0～8.0范圍內活性穩定。以不同濃度葡萄糖為底物在最適條件下測得該酶Km值為30.69mmol/L，Vmax為21.88μmol/L。Ag+、Cu2+、Zn2+對該酶活性有較大抑制作用。結果表明，該酶穩定性較好，有一定的應用價值。

黑曲霉；葡萄糖氧化酶；分離；純化；性質

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase EC 1.1.3.4，GOD)能夠在有氧的情況下催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸[1]。這種酶在自然界中有廣泛分布，在工業生產中多以黑曲霉、青霉等微生物為主要來源[2]。葡萄糖氧化酶在食品加工、釀酒[3]及醫藥衛生行業均有廣泛應用[4]，故生產高活性且成本低廉的葡萄糖氧化酶有重要意義。目前用黑曲霉為原材料分離純化葡萄糖氧化酶已有報道，王志新[5]提純黑曲霉A9的GOD比活力為349.84U/mg，美國Sigma公司生產的商品GOD比活力為266.82U/mg，中國科學院武漢病毒研究所構建的重組酵母所產GOD比活力為426.25U/mg[6]，但是酶活力和比活力均不理想。為此，本實驗嘗試用實驗室葡萄糖氧化酶高產菌株黑曲霉H1-9b作為出發菌株，發酵生產并分離純化葡萄糖氧化酶，同時對其部分性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基與試劑

黑曲霉(Aspergillius niger)H1-9b由西南大學生命科學學院酶工程實驗室保存。

培養基參考文獻[7]配制。發酵培養基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO42、MgSO4·7H2O 0.7、 KCl 0.5、NaNO34， pH5.5；斜面培養基(g/L)：蔗糖 30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO40.5、FeSO40.01、瓊脂 20，pH5.5。

DEAE-Sephrose(DEAE-瓊脂糖)、Superdex-200(葡聚糖凝膠)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 香港Farco公司；牛血清白蛋白(bovine seyum albumin)、卵清蛋白(ovalbumin chicken)、胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibtor)、溶菌酶(lysozyme)、藍色葡聚糖-2000、蛋白質SDSPAGE標準品 美國Promega公司；載體兩性電解質 美國Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MC4L冷凍干燥機 德國Uniequip公司；DYY-Ⅱ型電泳儀 北京六一儀器廠；UV-2550 PC型分光光度計日本島津公司；BSZ-2型自動雙蒸餾水儀 上海博通化學科技有限公司；高速冷凍離心機 日本玖保田公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠；Powerlook 2100XL凝膠掃描儀 臺灣Umax公司；AKTA prime plus蛋白質純化系統 美國GE公司。

1.3 葡萄糖氧化酶的發酵

1.3.1 種子液培養

在斜面培養基上接種黑曲霉H1-9b孢子，28℃培養4～5d。

1.3.2 搖瓶發酵

250mL錐形瓶中分裝50mL發酵培養基，121℃滅菌20min，接種黑曲霉H1-9a孢子濃度為104個/mL，28℃、200r/min搖床培養80h即達產酶高峰。

1.3.3 菌絲體的制備

搖瓶發酵培養完成后，用紗布過濾發酵液，收集球狀菌絲體，用雙蒸水將其反復沖洗，直至把發酵液沖干凈；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸緩沖液沖洗菌絲體，壓干水分，稱質量后收集備用。

1.4 酶的分離純化

1.4.1 粗酶液的制備

本實驗采用研磨法破碎菌絲體。將菌絲體置于研缽中，加入適量石英砂，對菌體進行研磨；充分研磨后按1:1(m/V)加入預冷的0.2mol/L pH5.7磷酸緩沖液浸提粗酶，4℃抽提2h。抽提完成后4℃、12000r/min離心20min，取上清液，即為粗酶液，透析1d后收集備用。

1.4.2 DEAE-Sepharose離子交換層析

用300mL 0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡DEAE-Sepharose離子交換層析柱，取5mL粗酶液上樣，用0～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的 Tris-HCl緩沖溶液配制)進行梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管收集5mL，層析完成后收集GOD活性管，透析脫鹽，冷凍干燥后備用。

1.4.3 Superdex-200凝膠過濾層析

用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡Superdex-200凝膠過濾層析柱過夜，將冷凍干燥后的樣品加水稀釋至2mL上樣，用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液進行洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL，層析完成后收集GOD活性管，透析脫鹽，冷凍干燥得到GOD純品。

1.5 酶活力的測定

參照文獻[8-9]報道的方法并加以改進。取適當稀釋后酶液50μL，加入2.0mL 0.1mol/L pH5.7磷酸緩沖溶液，0.3mL 質量分數10%葡萄糖溶液，50μL 16mmol/L 4-氨基安替吡啉，50μL 7.5mmol/L苯酚，50μL過氧化物酶(1000U/mL)，在37℃準確反應4min，再置于沸水浴中快速滅活4min，冷卻至室溫，在波長500nm處測定其吸光度；空白對照除酶液預先滅活，其他處理相同。將每分鐘消耗1μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個活力單位(U)。

1.6 蛋白質含量的測定

用Bradford等[10]方法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品。

1.7 GOD分子質量測定

用凝膠過濾法[11]測定GOD全分子質量，SDS-PAGE法[12]測定GOD亞基分子質量。8% SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，電泳后用考馬斯亮藍R-250染色。

1.8 酶的性質測定

1.8.1 最適pH值及pH值穩定性

37℃條件下，測定GOD在不同pH值(4.0～8.0)緩沖溶液中的酶活力；將GOD置于不同pH值(4.0～8.0)緩沖溶液中，測定25℃保存7d后的酶活力。以最大酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比，計算相對酶活力。

1.8.2 最適溫度及熱穩定性

分別測定GOD在不同溫度(20～80℃) 條件下的酶活力，及在30～70℃條件下分別保溫1、2、3、4、5h后的酶活力。以最大酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比，計算相對酶活力。

1.8.3 GOD的Km值及Vmax測定

在最適條件下，以不同濃度(25～75mmol/L)的葡萄糖為底物，測定其酶活力，并按雙倒數法(Lineweaver-Burk法[13])作圖，求出其Km值及Vmax。

1.8.4 金屬離子對酶活性的影響

將GOD與不同的金屬離子溶液混合，使金屬離子的終濃度為1～7mmol/L或0.25～1.5mmol/L，4℃放置30min后，在最適條件下測定其酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%(作為標準管)，添加金屬離子后的殘酶活力與標準管酶活力之比即為相對酶活力。金屬離子分別為：Li+、K+、Ag+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Pb2+。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶的分離純化

粗酶液經D E A E-S e p h a r o s e離子交換層析和Superdex-200凝膠過濾層析洗脫曲線如圖1、2所示，酶的分離純化結果見表1。從整個分離純化過程看，純化效果較好，純化倍數較高。

圖1 黑曲霉H1-9b所產GOD的DEAE-Sepharose離子交換層析曲線Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of GOD from A. niger H1-9b

圖2 黑曲霉H1-9b所產GOD的Superdex-200凝膠過濾層析曲線Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of GOD from A. Niger H1-9b

表1 黑曲霉H1-9b所產GOD純化結果Table 1 Purification of GOD from A. niger H1-9b

2.2 酶的純度鑒定

由Superdex-200凝膠過濾層析純化的酶液經SDSPAGE分析，用考馬斯亮藍R-250染色，呈現單一條帶，說明該酶已經達到電泳純(圖3)。

圖3 黑曲霉H1-9b所產GOD的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of GOD from A. niger H1-9b

2.3 酶的分子質量

經Superdex-200凝膠過濾層析測得酶的分子質量約為94.1kD，經SDS-PAGE測得酶的亞基分子質量約為94.0kD，可見黑曲霉H1-9b所產GOD是單亞基酶。

2.4 酶的性質鑒定

2.4.1 最適pH值及pH值穩定性

圖4 pH值對黑曲霉H1-9b所產GOD酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of GOD from A. niger H1-9b

由圖4可見，在37℃時，黑曲霉H1-9b 所產GOD在pH5.7左右活性最強，在pH5.0～7.0范圍內酶活力較高，超出此范圍酶活力顯著下降。

圖5 黑曲霉H1-9b所產GOD的pH值穩定性Fig.5 pH stability of GOD from A. niger H1-9b

由圖5可見，將酶與不同pH值的緩沖溶液混合，25℃放置7d后，保存在各個pH值下的GOD相對酶活力均保持在80%以上，說明該酶在pH4.0～8.0范圍內穩定性良好。

2.4.2 最適溫度及熱穩定性

圖6 溫度對黑曲霉H1-9b所產GOD酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of GOD from A. nger H1-9b

圖7 黑曲霉H1-9b所產GOD的熱穩定性Fig.7 Thermostability of GOD from A. niger H1-9b

由圖6可見，黑曲霉H1-9b 所產GOD最適溫度為37℃。由圖7可見，該酶在30～40℃具有較好的熱穩定性，保溫5h后相對酶活力在50%左右，超過50℃后活力損失較大，在70℃保溫5h后酶活力基本喪失。

2.4.3 酶的米氏常數

以不同濃度葡萄糖為底物，測得黑曲霉H1-9b所產GOD的Km值為30.69mmol/L，Vmax為21.88μmol/(L·s) (圖8)。

圖8 黑曲霉H1-9b所產GOD的Km值Fig.8 Km of GOD from A. niger H1-9b

2.4.4 金屬離子對黑曲霉H1-9b所產GOD酶活性的影響

表2 金屬離子對黑曲霉H1-9b所產GOD酶活力的影響Table 2 Effects of Li+, K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+and Pb2+on the activity of GOD from A. niger H1-9b

如表2所示，金屬離子Li+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+在1～7mmol/L濃度范圍內對黑曲霉H1-9b GOD的活性影響不大，活力均保持在80%以上。而Zn2+、Cu2+、Ag+對其活性影響較大，抑制作用明顯，見圖9。尤其是Ag+，當其濃度達到1mmol/L時，GOD活性已經完全喪失。Co2+在低濃度下對GOD有雙重作用，當濃度小于1mol/L時，對該酶有抑制作用，但隨著濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱。

圖9 Co2+、Zn2+、Cu2+、Ag+對黑曲霉H1-9b所產GOD酶活力的影響Fig.9 Effects of Co2+, Zn2+, Cu2+and Ag+on the activity of GOD from A. nger H1-9b

3 討論與結論

本實驗從黑曲霉H1-9b中分離得到GOD純品，該酶的比活為30569.7U/mg，回收率為30.2%，純化倍數為41.4倍。尤其是在離子交換層析后，酶比活力呈大幅度上升，分離效果較好。張婷[14]、Simpson等[15]純化的GOD均由兩個亞基組成，酶蛋白分子質量分別為160、148kD，而本實驗測得黑曲霉H1-9b所產GOD的分子質量為94kD，且為單亞基酶。這與普遍報道有所不同，說明GOD分子結構在不同來源的材料中具有特異性。

黑曲霉H1-9b 所產GOD的熱穩定性一般，在30～40℃的溫度范圍內保溫5h后相對酶活力在50%以上，在工業生產中可以在常溫下使用。該酶的pH值(pH4.0～8.0)穩定性較高，說明該酶的酸堿耐受力好，可在較寬廣的pH值范圍內發揮作用，有較高的應用價值。不同來源的GOD的Km值差異較大，張茜[16]純化的尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶Km值為122.6mmol/L，Rando等[17]報道的GOD的Km值為6.2mmol/L，本實驗中測得黑曲霉H1-9b所產GOD的Km值為30.69mmol/L，與王志新[5]的實驗結果(Km值35.74mmol/L)較為接近，顯示黑曲霉H1-9b所產GOD對葡萄糖的親和力較好。

Zn2+、Cu2+、Ag+對黑曲霉H1-9b 所產GOD的活性有抑制作用，而在Kelley 等[18]的實驗中當Cu2+達到10mmol/L時，GOD活性仍沒有被抑制。Ag+對該酶的抑制作用很強，當其濃度增加到1mmol/L時，GOD活性已被完全抑制，故認為Zn2+、Cu2+、Ag+是該酶的金屬離子抑制劑。Co2+對黑曲霉H1-9b 所產GOD的作用比較特殊，當Co2+濃度低于1mmol/L時，GOD的活性受到了抑制，降至85%，而隨著Co2+濃度的逐漸增加，它對GOD活性的抑制作用減弱，直至其濃度達到6～7mmol/L時，GOD的相對酶活力又上升至100%。其原因可能是：GOD酶分子上對Co2+有不同的結合位點，類似于許強等[19]用紫外差分吸收光譜技術研究葡萄糖異構酶與金屬離子作用時得出當金屬離子和葡萄糖異構酶分子結合后，每個酶分子對金屬離子至少存在強弱兩種結合位點。據此推測GOD與Co2+結合后，也可能存在強弱結合位點，當Co2+濃度低時，Co2+與酶分子的強結合位點結合，改變了酶的分子結構，但又不足以達到穩定結構的作用，所以使得酶活力略微下降，當濃度升高以后，強弱結合位點均被占據，達到穩定酶分子結構的作用，酶活力回升。而在本實驗中涉及的其他金屬離子：Li+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+則在1～7mmol/L濃度范圍內對該酶活性的影響不大，且未發現對GOD活性有明顯激活作用的金屬離子。

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Isolation, Purification and Some Properties of Glucose Oxidase from Aspergillius niger H1-9b

SU Mo，GAO Ya-peng，LIANG Jian-rong，HUANG Jie，TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Glucose oxidase (GOD), an H2O2-producing enzyme, was isolated and purified from Aspergillius niger H1-9b through electrophoretic homogeneity, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose column and Superdex-200 gel filtration chromatography. The purified GOD had a molecular weight of 94.1 kD as a monomer. The specific activity of GOD was 30569.7 U/mg with recovery rate of 30.2% and purification fold of 41.4. The optimal reaction pH and temperature of GOD were 5.7 and 37 ℃, respectively. The GOD displayed an excellent stability under the conditions of 30-40 ℃ and pH 4.0-8.0. The kinetic parameters such as Km and Vmax were 30.69 mmol/L and 21.88μmol/L while using glucose as the substrate. Obvious inhibitory effects of Ag+, Cu2+and Zn2+on the activity of GOD were observed. Therefore, glucose oxidase from Aspergillius niger H1-9b will have wide applications due to its excellent thermostability and stability in wide pH range.

Aspergillius niger H1-9b；glucose oxidase；isolation；purification；property

Q946.5

A

1002-6630(2011)03-0181-05

2010-04-21

重慶市科學技術委員會科技攻關項目(CSCT2004AC1012)

蘇茉(1986—)，女，碩士研究生，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：chaos421@163.com

*通信作者：唐云明(1960—)，男，教授，博士，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：tbright2008@126.com