馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶作用的研究

張洪江，張紅英，王 玉

馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶作用的研究

張洪江1，張紅英2,*，王 玉3

(1.延邊大學附屬醫院檢驗科，吉林 延吉 133000；2.延邊大學基礎醫學院機能學實驗中心，吉林 延吉 133002；3.延邊大學醫學部，吉林 延吉 133002)

目的：研究馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力及其作用機制。方法：取小鼠隨機分為正常組、模型組、馬齒莧正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d))組。除正常組頸部皮下注射生理鹽水外，其他各組均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))，注射后每天下午灌胃給藥，連續造模42d。采用避暗和水迷宮法測定衰老小鼠學習記憶能力，同時測定小鼠腦組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。結果：馬齒莧正丁醇提取物組均可提高衰老小鼠學習記憶能力，并明顯降低腦組織MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性。結論：馬齒莧正丁醇提取物能明顯改善衰老小鼠學習記憶障礙，其機制可能與提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有關。

馬齒莧；正丁醇；學習記憶；MDA；SOD；GSH-Px

馬齒莧(Portulaca oleracea Linn)廣泛分布于我國南北地區，資源豐富，是一種具有很大開發潛力的植物。馬齒莧科植物的全草又名長壽菜，性寒味酸具有清熱解毒、散血消腫之功效。馬齒莧是中國衛生部劃定的藥食同源的野生植物之一。馬齒莧含有豐富的化學成分，具有廣泛的藥理活性及營養保健作用[1]。曾小玲[2]報道鮮馬齒莧沸水提取物對超氧陰離子自由基和羥自由基均有顯著的清除作用。馬齒莧水提液可明顯延長模型小鼠的缺氧生存時間、爬桿時間，提高其高溫存活率[3]，據此推測馬齒莧提取物可能具有改善學習記憶的作用。本實驗研究馬齒莧提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶的影響，從清除氧自由基的能力方面初步探討其作用機制。為進一步開發應用馬齒莧提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬齒莧購于吉林省延邊大學附屬醫院中藥房，經延邊大學藥學院生藥教研室劉永鎮教授鑒定為真品。

昆明種小鼠(均為雌性)，體質量24～26g，由延邊大學醫學院動物科提供(動物合格證號：10-1022)。

D-半乳糖(批號F20080429) 國藥集團化學試劑有限公司；SOD、MDA、GSH-Px試劑盒(批號2008.11.23)南京建成生物工程研究所。

2H-500型小鼠避暗儀 安徽正華教學實驗機械廠；LW-Π型自動記錄水迷宮 中國醫學科學院藥物研究所；YP600型電子稱、VIS-723型可見分光光度儀 上海精密科學儀器有限公司；超級恒溫水浴裝置 上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧正丁醇提取物制備

稱取馬齒莧干草1300g粉碎，用體積分數75%乙醇在水浴中回流提取2次，先用10倍量乙醇提取2h，然后再用8倍量乙醇提取1h，冷卻后過濾，合并濾液濃縮，水懸浮液以乙酸乙酯萃取濃縮至浸膏，水層揮盡乙酸乙酯，用飽和正丁醇萃取。正丁醇層濃縮得浸膏，干燥成粉末，臨用前配成所需濃度。

1.2.2 實驗分組造模及給藥

取雌性昆明種小鼠，在實驗室適應2d，隨機分為4組，即正常組、模型組、馬齒莧正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d)，以體質量計)組。D-半乳糖致衰老小鼠模型的制備[4]：采用無菌注射方法，每日上午，除正常組頸部皮下注射生理鹽水外，其他各組均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))進行造模，每日1次連續造模42d。注射D-半乳糖后每日下午，生理鹽水和模型組灌胃給蒸餾水，藥物組灌胃給馬齒莧正丁醇提取物，每日1次連續灌胃給藥42d。

1.2.3 小鼠避暗實驗[5]

避暗箱大小為36cm×12cm×12cm，分為前后明暗室兩部分，兩室間有直徑3cm的圓洞相通，底部為銅柵，暗室后半部通以40V電壓。訓練時將小鼠背對洞口放入明室，暗室底部通電，同時啟動計時器，小鼠穿過洞口進入暗室觸電的時間，為實驗潛伏期，進行訓練5min，24h后進行正式實驗，將小鼠背對洞口放入明室，同時啟動計時器，記錄每只小鼠第1次進入暗室的時間，即為逃避潛伏期，并記錄5min內進入暗室的次數(即避暗錯誤次數)。

1.2.4 小鼠水迷宮實驗[6]

裝置為32cm×12cm×25cm雙層不透明的有機玻璃槽，實驗時水深為10cm，水溫保持25℃左右。第一次訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自行爬上3次，然后將小鼠背對出口放入A點開始訓練。第二次訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自行爬上一次，將小鼠背對出口放入B點開始訓練。正式實驗時將小鼠背對出口從B點開始放入小鼠，同時按下啟動鍵，儀器開始自動記時，小鼠到達終點或時間到2min時，儀器自動停記。

1.2.5 腦組織蛋白質、MDA含量及SOD、GSH-Px活性的測定

實驗結束后，取腦組織冰浴研磨，并用冷生理鹽水制成10%勻漿液，3500r/min離心10min，取上清液按試劑盒方法測定腦組織蛋白質、MDA含量和SOD、GSH-Px活性(以單位質量蛋白計)。

1.2.6 統計學處理

2 結果與分析

2.1 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響(避暗法)

表1 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

表1 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

注：*.與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別劑量/動物數 避暗法測定指標(g/(kg·d))潛伏期/s錯誤次數正常組—1591.54±2.800.87±0.92模型組—1229.73±3.755.17±6.94提取物高劑量組0.512109.78±5.51**0.42±0.67**提取物低劑量組0.2517140.63±4.12**0.18±0.53**

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠潛伏期明顯縮短和錯誤次數明顯增加；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠潛伏期延長和錯誤次數明顯減少(P＜0.01)。

2.2 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響(水迷宮法)

表2 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

表2 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

組別劑量/動物數 水迷宮法測定指標(g/(kg·d))到達時間/s錯誤次數正常組—1558.23±26.93**10.92±8.69**模型組—12102.36±30.5824.36±7.46提取物高劑量組0.51248.45±38.35**8.50±4.97**提取物低劑量組0.251758.25±28.41**11.50±5.68**

由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠到達時間延長和錯誤次數明顯增加；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠到達時間縮短和錯誤次數明顯減少(P＜0.01)。

2.3 對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響

表3 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

表3 馬齒莧正丁醇提取物對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

組別劑量/動物數SO D/MD A含量/GSH-P X/ (g/(kg·d))(U/m g)(nmol/ mg)(U/ mg )正常組—1089.8±14.6*4.8±0.762.7±19.2模型組—1042.6±13.25.0±1.533.2±8.5提取物高劑量組0.51081.0±33.5*4.0±0.951.4±12.9**提取物低劑量組0.251063.5±14.73.3±0.8*48.9±19.9

由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-PX活性下降；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-PX活性明顯上升(P＜0.05，P＜0.01)；與正常組相比，模型組小鼠腦組織MDA含量明顯上升；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織MDA含量明顯下降(P＜0.05)。

3 討 論

衰老是生命過程中正常而又復雜的生物過程，有關衰老的學說很多，1956年所提出的自由基衰老假說受到廣泛的支持[7]。

D-半乳糖致衰老小鼠模型：D-半乳糖在半乳糖氧化酶作用下，氧參與反應，生成糖和過氧化氫反應過程中產生超氧陰離子自由基，其過量損傷可產生衰老反應。該模型在一定時間內連續注射D-半乳糖，使機體細胞內半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化作用下，還原成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，致細胞腫脹，功能障礙代謝紊亂，氧自由基堆積最終致機體衰老[7]。連續頸背部皮下注射造成衰老模型，此模型造模簡單易行，不需要特殊設備，本模型基本接近自然衰老過程。

避暗法實驗中，D-半乳糖可使衰老小鼠潛伏期明顯縮短和錯誤次數明顯增加，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠潛伏期明顯延長和錯誤次數明顯減少。

水迷宮法實驗中，D-半乳糖可使衰老小鼠到達時間延長和錯誤次數明顯增加，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物均可使衰老小鼠到達時間明顯縮短和錯誤次數明顯減少。說明馬齒莧正丁醇提取物可提高衰老小鼠學習記憶能力。

自由基學說認為引起人體衰老的主要原因是人體細胞代謝過程中產生的自由基，因其具有高度的化學性，并能與活細胞的大部分發生反應，損傷DNA分子，造成DNA鍵的斷裂，使細胞死亡或發生突變[8]。

SOD作為機體內主要的抗氧化酶對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。此酶可促使超氧陰離子自由基轉變為過氧化氫，從而減少脂過氧化反應，使機體細胞和組織免受損害，其活力的高低間接反應映了機體清除氧自由基的能力，并與衰老、腫瘤、炎癥等有著密切聯系[9]。實驗結果表明，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組能提高衰老小鼠腦組織SOD活性。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂過氧化物，它能生成聚合物并與人體內的蛋白質和脫氧核糖核酸發生反應，使蛋白質的結構發生變異，導致變異蛋白質的細胞失去正常功能并向初期癌細胞轉化，從而導致癌癥的發生。MDA含量的變化可間接反應組織中氧自由基含量的變化量[10]。實驗結果表明，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可明顯降低衰老小鼠腦組織MDA含量。

GSH-Px是機體廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽H2O2的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用，從而減緩衰老過程[11]。與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d)) 組能提高衰老小鼠腦組織GSH-Px活性。

本次實驗中，D-半乳糖可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量有所上升，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性明顯上升，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織MDA含量明顯下降。說明，馬齒莧正丁醇提取物可能通過增加氧自由基清除能力來改善學習記憶障礙。

綜上所述，馬齒莧正丁醇提取物可提高衰老小鼠學習記憶能力，其機制可能與提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有關。

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Effects of n-Butanol Extracts from Portulaca oleracea on the Learning and Memory Performances of Senile Mice Induced by D-Gal

ZHANG Hong-jiang1，ZHANG Hong-ying2,*，WANG Yu3
(1. Clinical Laboratory Room, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China；2. Functional Laboratory Center, Basic Medical College of Yanbian University, Yanji 133002, China；3. Yanbian University Health Science Center, Yanji 133002, China)

Objective: To study the effects of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on the learning and memory performances of senile mice induced by D-gal and its mechanisms. Method: The mice were randomly divided into 3 groups: control group, model group and the n-butanol extracts (0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d)) groups. The control group was given hypodermic injection of isotonic NaCl in the transverse part while the other groups successively administered with D-gal (1 g/(kg·d)). After injection of medicine in the afternoon of every day model animals were obtained after 42 d of treatment. Learning and memory performances were measured by step-through test and water maze test and the amount of MDA in mouse brain tissue and the activities of SOD and GSH-Px were determined. Results: Portulaca oleracea n-butanol extracts could improve the learning and memory performances of mice at both 0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d), and substantially reduce contents of MDA in brain tissues and improve activities of SOD and GSH-Px. Conclusion: Portulaca oleracea n-butanol extracts can markedly improve learning and memory performances of senile mice. The mechanisms of effects may be related to the improvement of SOD and GSH-Px activities and the decrease of MDA.

Portulaca oleracea；n-butanol；learning and memory；MDA；SOD；GSH-Px

TS255.1

A

1002-6630(2011)03-0204-04

2010-05-31

張洪江(1968—)，男，主管檢驗師，研究方向為中藥生化藥理。E-mail：zhj1181@msn.cn

*通信作者：張紅英(1952—)，女，高級實驗師，研究方向為中藥心血管與抗衰老。E-mail：zhanghongying52@163.com