血漿激肽釋放酶 B1和緩激肽受體 B2基因多態性及體質指數與老年原發性高血壓的關系

鄒 力 李法琦 周 平 陳大林 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科,重慶 40006)

原發性高血壓是與多個遺傳基因有關的復雜性疾病,是多種心腦血管疾病重要的病因和危險因素之一。激肽釋放酶-激肽系統(KKS)參與高血壓發生發展的各個過程,其組成部分血漿激肽釋放酶 B1(KLKB 1)和緩激肽受體B2(BDKRB2)等在血壓和腎鈉調節中發揮重要作用。KLKB1基因和 BDKRB2基因是參與高血壓發病的候選基因之一〔1～3〕。近年來,雖有較多BDKRB2基因多態性與原發性高血壓關系的病例對照研究文獻報道,但不同人種不同地區的研究結果缺乏一致性,并且KLKB1和BDKRB2基因多態性與老年漢族人群高血壓的關系報道很少。流行病學研究表明體質指數(BMI)與高血壓發病密切相關〔4〕,而關于 KLKB1和 BDKRB2基因多態性與 BMI之間的協同作用尚無報道。我們應用限制性片段長度多態性-聚合酶鏈反應(RFLP-PCR)技術檢測重慶地區老年漢族原發性高血壓患者的 KLKB1和BDKRB2基因多態性,為進一步研究老年原發性高血壓發病機制提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 各組受檢者均為無血緣關系重慶地區老年漢族人群。老年原發性高血壓組共 103例,男 65例,女 38例,平均年齡(69.83±0.61)歲,均為本院體檢中心的體檢病人,經臨床及實驗室檢查確診為老年原發性高血壓患者,符合 1999年WHO/ISH高血壓防治指南的診斷標準〔4〕:收縮壓(SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg,排除繼發性高血壓、冠心病、先天性心臟病、心肌病、風濕性心瓣膜病、糖尿病、肝腎功能不良等。老年正常對照組共 103例,男 66例,女 37例,平均年齡(67.06±0.60)歲,均為我院體檢中心的健康老年體檢者,血壓 ＜140/90 mmHg,無心腦血管病、糖尿病、肝腎功能不良等。所有研究對象由經驗豐富的技術人員測量其身高、體重并計算 BMI。

1.2 儀器與試劑 S1000 Thermal Cycler PCR儀和凝膠/發光圖像分析系統購自美國BioRad公司;DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠;600型恒溫水浴箱購自江蘇省金壇市中大儀器廠;血液基因組DNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產;實驗所用的引物是根據NCBI數據庫的基因序列,應用堿基錯配法〔5,6〕構建酶切位點和 Primer5.0軟件自行設計,由上海生工生物工程技術服務有限公司和英俊生物技術有限公司合成;Hotstart-TaqDNA聚合酶、Mlu-Ⅰ和 Xsp-Ⅰ限制性內切酶為寶生物(大連)工程有限公司產品。

1.3 方法 ①提取血基因組:所有研究對象早晨采空腹靜脈血 5 ml,分離血清檢測其尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和血糖等相關生化指標;另取空腹靜脈血 2 ml使用血液基因組 DNA提取試劑盒提取DNA,-20℃保存。②KLKB 1基因 rs2304595位點目的片段PCR擴增與酶切消化:上游引物 5-CCCAGAAGAATAAAATTTGACGC-3;下游引物:5-GAGTAGAGGAACTTGGTGTGC-3。 PCR反應體積:模板 DNA約 100 ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,dNTP 0.56μl,10×PCR Buffer 0.7μl,加雙蒸水調至總體積 7μl。PCR反應條件:94℃預變性 5 min,然后 94℃變性 30 s,53℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45個循環,最后 72℃延伸 5 min。限制性內切酶消化反應總體積9μl,PCR產物 7μl,Mlu-Ⅰ限制性內切酶 7 U,10倍 H Buffer和雙蒸水共 2μl,37℃恒溫水浴箱酶切過夜。酶切產物用 3%瓊脂糖凝膠電泳,GoldenView染色,紫外燈下觀察結果并拍照。③BDKRB2基因rs1799722位點目的片段 PCR擴增與酶切消化:上游引物:5-CAGAGCGGAGAGCGAAGGTGG-3;下游引物:5-GCTCATCTTTCAAGGGCTGGCTA-3。PCR反應體積:模板 DNA約100ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,d NTP 0.48μl,10倍 PCR Buffer 0.6μl,加雙蒸水調至總體積6μl。PCR反應條件:94℃預變性 5min,然后 94℃變性 30s,57℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45個循環,最后 72℃延伸5 min。限制性內切酶消化反應總體積 9μl,PCR產物 6μl,Xsp-Ⅰ限制性內切酶 12 U,10倍 K Buffer和雙蒸水共 3μl,37℃恒溫水浴箱酶切過夜。酶切產物用 3%瓊脂糖凝膠電泳,GoldenView染色,紫外燈下觀察結果并拍照。

1.4 統計學處理 所有數據采用 SPSS13.0統計軟件進行分析,數據用±s表示,計數資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,遺傳平衡檢驗采用 Hardy-Weinberg平衡定律,高血壓的危險因素采用 Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1 兩組人群的基本臨床資料的比較 老年漢族原發性高血壓組 SBP、DBP、BMI的檢驗結果顯著高于正常對照組(P＜0.05),而年齡、性別、身高、體重、BUN、Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C和血糖兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表 1。

2.2 Harding-Weinberg平衡檢驗 經 χ2檢驗老年漢族原發性高血壓組和老年漢族正常對照組的 KLKB1基因 rs2304595位點基因型分布以及 BDKRB2基因rs1799722位點基因型分布均未偏離 H-W平衡(P＞0.05)。

2.3 KLKB1基因rs2304595位點多態性分析 3%瓊脂糖凝膠電泳顯示 rs2304595位點的GG野生型純合子為 1個 147 bp的條帶,AA突變型純合子為 1個 169 bp的條帶,GA突變型雜合子則同時具有 147 bp和 169 bp兩個條帶。見圖 1。KLKB1基因型 GG基因型和G等位基因攜帶者老年原發性高血壓發病風險(OR值)分別是正常對照組的 1.60倍和 1.49倍,檢驗GG基因型和 G等位基因頻率差異無統計學意義(P=0.093和P=0.058)。在老年原發性高血壓男性亞組和正常對照男性亞組中 GG基因型和 G等位基因的頻率差異無統計學意義(P=0.93和 P=0.89);但是,在老年原發性高血壓女性亞組和正常對照女性亞組中 GG基因型和 G等位基因的頻率,差異顯著(χ2=7.302,P=0.007和 χ2=8.204,P=0.004),并且 GG基因型和 G等位基因女性攜帶者老年原發性高血壓發病風險(OR值)明顯增高,分別是女性正常對照組的 3.71倍和 2.74倍。見表 2。

表1 兩組人群的臨床和生化檢查資料(±s,n=103)

表1 兩組人群的臨床和生化檢查資料(±s,n=103)

與正常對照組比較:1)P＜0.05

組別 原發性高血壓組 正常對照組身高(cm) 159.82±0.85 160.72±0.78體重(kg) 63.66±0.84 60.43±0.98 SBP(mmHg) 153.58±2.081) 133.26±1.38 DBP(mmHg) 83.38±1.491) 74.94±0.89 BMI(kg/m2) 24.97±0.271) 23.30±0.28 BUN(mmol/L) 5.70±0.14 5.95±0.22 Cr(μmol/L) 75.23±2.03 74.74±1.53 UA(μmol/L) 363.84±9.21 318.97±6.89 TC(mmol/L) 5.21±0.10 5.03±0.08 TG(mmol/L) 1.50±0.07 1.54±0.09 HDL-C(mmol/L) 1.15±0.06 1.45±0.04 LDL-C(mmol/L) 2.23±0.12 2.54±0.07血糖(mmol/L) 5.28±0.06 5.33±0.12

圖1 rs2304595位點電泳圖片

2.4 BDKRB2基因rs1799722位點多態性分析 3%瓊脂糖凝膠電泳顯示 rs1799722位點 CC野生型純合子為 1個 126 bp的條帶,TT突變型純合型為 1個 148 bp的條帶,CT突變型雜合子則同時具有 126 bp和 148 bp兩個條帶。見圖 2。原發性高血壓組和正常對照組 CC、CT、TT型基因頻率和 C、T等位基因頻率無差異(P=0.43和 0.28),并且各性別亞組 CC基因型和C等位基因頻率差異也無統計學意義(P＞0.05),見表 3。

表2 兩組 KLKB1基因 rs2304595基因型與等位基因分布頻率比較〔n(%),n=103〕

與正常對照組女性比較:1)P＜0.05

圖2 rs1799722位點電泳圖片

表3 兩組BDKRB 2基因 rs1799722基因型與等位基因分布頻率比較〔n(%),n=103〕

2.5 BMI與血壓的關系 BMI≥25 kg/m2個體老年原發性高血壓發病風險明顯高于老年正常對照組(OR=3.62),老年原發性高血壓發病差異有顯著統計學意義(χ2=17.21,P＜0.000 1),且隨 BMI的增大發病風險呈趨勢性增高。見表 4。

表4 兩組 BMI與血壓的關系〔n(%),n=103〕

2.6 Logistic回歸分析 老年原發性高血壓發病危險因素的Logistic回歸分析結果表明:KLKB1基因rs2304595位點 GG基因型和BMI均不同程度地增加老年原發性高血壓發病的危險性(GG基因型:OR=4.474,95%CI:2.284～8.766;BMI:OR=3.302,95%CI:1.707～6.387),二者之間存在協同作用,其中GG基因型對老年原發性高血壓發病的影響更大(P＜0.01)。而 BDKRB 2基因rs1799722位點CC基因型對老年原發性高血壓發病無影響(P＞0.05)。見表 5。

表5 Logistic回歸分析

3 討 論

KLKB1和BDKRB2基因分別位于人類染色體區域 4q34-q35和 14q32.1-q32.2,是參與原發性高血壓發病的候選基因之一〔2,3,6,7〕。本項研究中的老年原發性高血壓組和老年正常對照組均是重慶地區漢族人群,基因型分布檢驗符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說明本項研究結果具有一定的群體代表性。目前已有KLKB1基因 rs2304595位點A/G多態性和原發性高血壓發病相關的報道〔6〕,但尚未見該基因多態性與老年漢族人群高血壓發病有關的陽性報道。本項研究表明 GG基因型和 G等位基因可能是老年漢族女性原發性高血壓發病的一個遺傳標志。BDKRB2基因 rs1799722位點的T/C基因多態性的研究報道之間缺乏一致性。 Mukae等〔2〕報道日本人群〔2〕、Wang等〔8〕報道我國漢族人群以及有關非洲裔美國人群的報道〔3,7〕發現 rs1799722位點 CC基因型攜帶者的原發性高血壓發病明顯高于對照組,而 Fu等〔9〕報道日本人群、李南方等〔10〕報道中國哈薩克族人群以及西方高加索人群(Caucasian)的報道〔7,11〕認為該位點 T/C基因多態性與原發性高血壓發病無關。本研究發現重慶地區老年漢族原發性高血壓組和正常對照組CC基因型和 C等位基因無差異,并且在男女亞組中也未發現有差異。這些研究結果之間缺乏一致的原因可能是由于西方高加索人群和中國哈薩克族人群構成復雜、DNA的種族多樣性、基因內部結構的細微差異所致,也可能是因為高加索人群、日本人群和本項研究對象的選擇標準、地域環境和生活習慣存在差異等因素所造成。

上述統計結果是把KLKB1和 BDKRB 2基因多態性作為老年原發性高血壓發病原因的單個因素來考察的,而環境因素對原發性高血壓的發病起重要作用。流行病學調查證實肥胖或超重是與原發性高血壓密切相關的危險因素,肥胖能夠導致和加重許多心血管疾病。亞太地區肥胖與超重標準專題研討會提出 BMI≥25 kg/m2為肥胖,BMI與血壓呈顯著的正相關,前瞻性研究表明,基線 BMI每增加 1kg/m2,高血壓發病危險 5年內增加 9%〔4,12〕。本研究表明 KLKB1基因 rs2304595位點 GG基因型和BMI均不同程度的增加老年原發性高血壓的發病風險,且二者協同作用影響高血壓的發病,其中 GG基因型對高血壓發病的影響更大。因此,降低BMI是削弱KLKB1基因 GG基因型對老年原發性高血壓發病的良好措施。

1 Yu H,Bowden DW,Spray BJ,et al.Identification of human plasma kallikrein gene polymorphisms and evaluation of their role in end-stage renal disease〔J〕.Hypertension,1998;31(4):906-11.

2 Mukae S,Aoki S,Itoh S,et al.Promoter polymorphism of thebeta2bradykinin receptor gene isassociated with essential hypertension〔J〕.Jpn Circ J,1999;63(10):759-62.

3 Gainer JV,Brown NJ,Bachvarova M,etal.Altered frequency of apromoter polymorphism of the kinin B2 receptor gene in hypertensive African-A-mericans〔J〕.Am J Hypertens,2000;13(12):1268-73.

4 王吉耀.內科學〔M〕.北京:人民衛生出版社,2002:229-34.

5 李洪義,曾瑞萍,杜傳書.用一對錯配引物進行的 PCR/酶解法檢測β-地中海貧血-28(A→G)突變〔J〕.中山醫科大學學報,1993;14(4):封 2,封 4.

6 Lu X,Zhao W,Huang J,et al.Common variation in KLKB1 and essential hypertension risk:tagging-SNP haplotype analysis in a case-control study〔J〕.Hum Genet,2007;121(3-4):327-35.

7 Cui J,Melista E,Chazaro I,et al.Sequence variation of bradykinin receptors B1 and B2and association with hypertension〔J〕.J Hypertens,2005;23(1):55-62.

8 Wang B,Dang A,Liu G.Genetic variation in the promoter region of the beta2 bradykinin receptor gene is associated with essential hypertension in a Chinese Han population〔J〕.Hypertens Res,2001;24(3):299-302.

9 Fu Y,Katsuya T,Matsuo A,et al.Relationship of bradykinin B2 receptor gene polymorphism with essential hypertension and left ventricular hypertrophy〔J〕.Hypertens Res,2004;27(12):933-8.

10 李南方,汪迎春,周 玲,等 .緩激肽 β2受體基因啟動子區-58T/C多態性與哈薩克族原發性高血壓的相關性分析〔J〕.醫學分子生物學雜志,2008;5(2):110-3.

11 Milan A,Mulatero P,Williams TA,et al.Bradykinin B2 receptor gene(-58T/C)polymorphism influences baroreflex sensitivity in never-treated hypertensive patients〔J〕.JHypertens,2005;23(1):63-6.

12 Mori MA,Araujo RC,Reis FC,et al.Kinin B1 receptor deficiency leads to leptin hypersensitivity and resistance to obesity〔J〕.Diabetes,2008;57(6):1491-500.