血漿激肽釋放酶 B1和緩激肽受體 B2基因多態(tài)性及體質(zhì)指數(shù)與老年原發(fā)性高血壓的關(guān)系

鄒 力 李法琦 周 平 陳大林 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,重慶 40006)

原發(fā)性高血壓是與多個(gè)遺傳基因有關(guān)的復(fù)雜性疾病,是多種心腦血管疾病重要的病因和危險(xiǎn)因素之一。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)參與高血壓發(fā)生發(fā)展的各個(gè)過(guò)程,其組成部分血漿激肽釋放酶 B1(KLKB 1)和緩激肽受體B2(BDKRB2)等在血壓和腎鈉調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。KLKB1基因和 BDKRB2基因是參與高血壓發(fā)病的候選基因之一〔1～3〕。近年來(lái),雖有較多BDKRB2基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系的病例對(duì)照研究文獻(xiàn)報(bào)道,但不同人種不同地區(qū)的研究結(jié)果缺乏一致性,并且KLKB1和BDKRB2基因多態(tài)性與老年漢族人群高血壓的關(guān)系報(bào)道很少。流行病學(xué)研究表明體質(zhì)指數(shù)(BMI)與高血壓發(fā)病密切相關(guān)〔4〕,而關(guān)于 KLKB1和 BDKRB2基因多態(tài)性與 BMI之間的協(xié)同作用尚無(wú)報(bào)道。我們應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(RFLP-PCR)技術(shù)檢測(cè)重慶地區(qū)老年漢族原發(fā)性高血壓患者的 KLKB1和BDKRB2基因多態(tài)性,為進(jìn)一步研究老年原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 各組受檢者均為無(wú)血緣關(guān)系重慶地區(qū)老年漢族人群。老年原發(fā)性高血壓組共 103例,男 65例,女 38例,平均年齡(69.83±0.61)歲,均為本院體檢中心的體檢病人,經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查確診為老年原發(fā)性高血壓患者,符合 1999年WHO/ISH高血壓防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕:收縮壓(SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg,排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、先天性心臟病、心肌病、風(fēng)濕性心瓣膜病、糖尿病、肝腎功能不良等。老年正常對(duì)照組共 103例,男 66例,女 37例,平均年齡(67.06±0.60)歲,均為我院體檢中心的健康老年體檢者,血壓 ＜140/90 mmHg,無(wú)心腦血管病、糖尿病、肝腎功能不良等。所有研究對(duì)象由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員測(cè)量其身高、體重并計(jì)算 BMI。

1.2 儀器與試劑 S1000 Thermal Cycler PCR儀和凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioRad公司;DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠;600型恒溫水浴箱購(gòu)自江蘇省金壇市中大儀器廠;血液基因組DNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn);實(shí)驗(yàn)所用的引物是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列,應(yīng)用堿基錯(cuò)配法〔5,6〕構(gòu)建酶切位點(diǎn)和 Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和英俊生物技術(shù)有限公司合成;Hotstart-TaqDNA聚合酶、Mlu-Ⅰ和 Xsp-Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶為寶生物(大連)工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法 ①提取血基因組:所有研究對(duì)象早晨采空腹靜脈血 5 ml,分離血清檢測(cè)其尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和血糖等相關(guān)生化指標(biāo);另取空腹靜脈血 2 ml使用血液基因組 DNA提取試劑盒提取DNA,-20℃保存。②KLKB 1基因 rs2304595位點(diǎn)目的片段PCR擴(kuò)增與酶切消化:上游引物 5-CCCAGAAGAATAAAATTTGACGC-3;下游引物:5-GAGTAGAGGAACTTGGTGTGC-3。 PCR反應(yīng)體積:模板 DNA約 100 ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,dNTP 0.56μl,10×PCR Buffer 0.7μl,加雙蒸水調(diào)至總體積 7μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 min,然后 94℃變性 30 s,53℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸 5 min。限制性?xún)?nèi)切酶消化反應(yīng)總體積9μl,PCR產(chǎn)物 7μl,Mlu-Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶 7 U,10倍 H Buffer和雙蒸水共 2μl,37℃恒溫水浴箱酶切過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用 3%瓊脂糖凝膠電泳,GoldenView染色,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。③BDKRB2基因rs1799722位點(diǎn)目的片段 PCR擴(kuò)增與酶切消化:上游引物:5-CAGAGCGGAGAGCGAAGGTGG-3;下游引物:5-GCTCATCTTTCAAGGGCTGGCTA-3。PCR反應(yīng)體積:模板 DNA約100ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,d NTP 0.48μl,10倍 PCR Buffer 0.6μl,加雙蒸水調(diào)至總體積6μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min,然后 94℃變性 30s,57℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸5 min。限制性?xún)?nèi)切酶消化反應(yīng)總體積 9μl,PCR產(chǎn)物 6μl,Xsp-Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶 12 U,10倍 K Buffer和雙蒸水共 3μl,37℃恒溫水浴箱酶切過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用 3%瓊脂糖凝膠電泳,GoldenView染色,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用±s表示,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),遺傳平衡檢驗(yàn)采用 Hardy-Weinberg平衡定律,高血壓的危險(xiǎn)因素采用 Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組人群的基本臨床資料的比較 老年漢族原發(fā)性高血壓組 SBP、DBP、BMI的檢驗(yàn)結(jié)果顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05),而年齡、性別、身高、體重、BUN、Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C和血糖兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表 1。

2.2 Harding-Weinberg平衡檢驗(yàn) 經(jīng) χ2檢驗(yàn)老年漢族原發(fā)性高血壓組和老年漢族正常對(duì)照組的 KLKB1基因 rs2304595位點(diǎn)基因型分布以及 BDKRB2基因rs1799722位點(diǎn)基因型分布均未偏離 H-W平衡(P＞0.05)。

2.3 KLKB1基因rs2304595位點(diǎn)多態(tài)性分析 3%瓊脂糖凝膠電泳顯示 rs2304595位點(diǎn)的GG野生型純合子為 1個(gè) 147 bp的條帶,AA突變型純合子為 1個(gè) 169 bp的條帶,GA突變型雜合子則同時(shí)具有 147 bp和 169 bp兩個(gè)條帶。見(jiàn)圖 1。KLKB1基因型 GG基因型和G等位基因攜帶者老年原發(fā)性高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值)分別是正常對(duì)照組的 1.60倍和 1.49倍,檢驗(yàn)GG基因型和 G等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.093和P=0.058)。在老年原發(fā)性高血壓男性亞組和正常對(duì)照男性亞組中 GG基因型和 G等位基因的頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.93和 P=0.89);但是,在老年原發(fā)性高血壓女性亞組和正常對(duì)照女性亞組中 GG基因型和 G等位基因的頻率,差異顯著(χ2=7.302,P=0.007和 χ2=8.204,P=0.004),并且 GG基因型和 G等位基因女性攜帶者老年原發(fā)性高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值)明顯增高,分別是女性正常對(duì)照組的 3.71倍和 2.74倍。見(jiàn)表 2。

表1 兩組人群的臨床和生化檢查資料(±s,n=103)

表1 兩組人群的臨床和生化檢查資料(±s,n=103)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05

組別 原發(fā)性高血壓組 正常對(duì)照組身高(cm) 159.82±0.85 160.72±0.78體重(kg) 63.66±0.84 60.43±0.98 SBP(mmHg) 153.58±2.081) 133.26±1.38 DBP(mmHg) 83.38±1.491) 74.94±0.89 BMI(kg/m2) 24.97±0.271) 23.30±0.28 BUN(mmol/L) 5.70±0.14 5.95±0.22 Cr(μmol/L) 75.23±2.03 74.74±1.53 UA(μmol/L) 363.84±9.21 318.97±6.89 TC(mmol/L) 5.21±0.10 5.03±0.08 TG(mmol/L) 1.50±0.07 1.54±0.09 HDL-C(mmol/L) 1.15±0.06 1.45±0.04 LDL-C(mmol/L) 2.23±0.12 2.54±0.07血糖(mmol/L) 5.28±0.06 5.33±0.12

圖1 rs2304595位點(diǎn)電泳圖片

2.4 BDKRB2基因rs1799722位點(diǎn)多態(tài)性分析 3%瓊脂糖凝膠電泳顯示 rs1799722位點(diǎn) CC野生型純合子為 1個(gè) 126 bp的條帶,TT突變型純合型為 1個(gè) 148 bp的條帶,CT突變型雜合子則同時(shí)具有 126 bp和 148 bp兩個(gè)條帶。見(jiàn)圖 2。原發(fā)性高血壓組和正常對(duì)照組 CC、CT、TT型基因頻率和 C、T等位基因頻率無(wú)差異(P=0.43和 0.28),并且各性別亞組 CC基因型和C等位基因頻率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表 3。

表2 兩組 KLKB1基因 rs2304595基因型與等位基因分布頻率比較〔n(%),n=103〕

與正常對(duì)照組女性比較:1)P＜0.05

圖2 rs1799722位點(diǎn)電泳圖片

表3 兩組BDKRB 2基因 rs1799722基因型與等位基因分布頻率比較〔n(%),n=103〕

2.5 BMI與血壓的關(guān)系 BMI≥25 kg/m2個(gè)體老年原發(fā)性高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于老年正常對(duì)照組(OR=3.62),老年原發(fā)性高血壓發(fā)病差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.21,P＜0.000 1),且隨 BMI的增大發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈趨勢(shì)性增高。見(jiàn)表 4。

表4 兩組 BMI與血壓的關(guān)系〔n(%),n=103〕

2.6 Logistic回歸分析 老年原發(fā)性高血壓發(fā)病危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果表明:KLKB1基因rs2304595位點(diǎn) GG基因型和BMI均不同程度地增加老年原發(fā)性高血壓發(fā)病的危險(xiǎn)性(GG基因型:OR=4.474,95%CI:2.284～8.766;BMI:OR=3.302,95%CI:1.707～6.387),二者之間存在協(xié)同作用,其中GG基因型對(duì)老年原發(fā)性高血壓發(fā)病的影響更大(P＜0.01)。而 BDKRB 2基因rs1799722位點(diǎn)CC基因型對(duì)老年原發(fā)性高血壓發(fā)病無(wú)影響(P＞0.05)。見(jiàn)表 5。

表5 Logistic回歸分析

3 討 論

KLKB1和BDKRB2基因分別位于人類(lèi)染色體區(qū)域 4q34-q35和 14q32.1-q32.2,是參與原發(fā)性高血壓發(fā)病的候選基因之一〔2,3,6,7〕。本項(xiàng)研究中的老年原發(fā)性高血壓組和老年正常對(duì)照組均是重慶地區(qū)漢族人群,基因型分布檢驗(yàn)符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說(shuō)明本項(xiàng)研究結(jié)果具有一定的群體代表性。目前已有KLKB1基因 rs2304595位點(diǎn)A/G多態(tài)性和原發(fā)性高血壓發(fā)病相關(guān)的報(bào)道〔6〕,但尚未見(jiàn)該基因多態(tài)性與老年漢族人群高血壓發(fā)病有關(guān)的陽(yáng)性報(bào)道。本項(xiàng)研究表明 GG基因型和 G等位基因可能是老年漢族女性原發(fā)性高血壓發(fā)病的一個(gè)遺傳標(biāo)志。BDKRB2基因 rs1799722位點(diǎn)的T/C基因多態(tài)性的研究報(bào)道之間缺乏一致性。 Mukae等〔2〕報(bào)道日本人群〔2〕、Wang等〔8〕報(bào)道我國(guó)漢族人群以及有關(guān)非洲裔美國(guó)人群的報(bào)道〔3,7〕發(fā)現(xiàn) rs1799722位點(diǎn) CC基因型攜帶者的原發(fā)性高血壓發(fā)病明顯高于對(duì)照組,而 Fu等〔9〕報(bào)道日本人群、李南方等〔10〕報(bào)道中國(guó)哈薩克族人群以及西方高加索人群(Caucasian)的報(bào)道〔7,11〕認(rèn)為該位點(diǎn) T/C基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)病無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)老年漢族原發(fā)性高血壓組和正常對(duì)照組CC基因型和 C等位基因無(wú)差異,并且在男女亞組中也未發(fā)現(xiàn)有差異。這些研究結(jié)果之間缺乏一致的原因可能是由于西方高加索人群和中國(guó)哈薩克族人群構(gòu)成復(fù)雜、DNA的種族多樣性、基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異所致,也可能是因?yàn)楦呒铀魅巳骸⑷毡救巳汉捅卷?xiàng)研究對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)、地域環(huán)境和生活習(xí)慣存在差異等因素所造成。

上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果是把KLKB1和 BDKRB 2基因多態(tài)性作為老年原發(fā)性高血壓發(fā)病原因的單個(gè)因素來(lái)考察的,而環(huán)境因素對(duì)原發(fā)性高血壓的發(fā)病起重要作用。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)肥胖或超重是與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素,肥胖能夠?qū)е潞图又卦S多心血管疾病。亞太地區(qū)肥胖與超重標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)題研討會(huì)提出 BMI≥25 kg/m2為肥胖,BMI與血壓呈顯著的正相關(guān),前瞻性研究表明,基線 BMI每增加 1kg/m2,高血壓發(fā)病危險(xiǎn) 5年內(nèi)增加 9%〔4,12〕。本研究表明 KLKB1基因 rs2304595位點(diǎn) GG基因型和BMI均不同程度的增加老年原發(fā)性高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),且二者協(xié)同作用影響高血壓的發(fā)病,其中 GG基因型對(duì)高血壓發(fā)病的影響更大。因此,降低BMI是削弱KLKB1基因 GG基因型對(duì)老年原發(fā)性高血壓發(fā)病的良好措施。

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