老年患者惡性胸水中腫瘤浸潤免疫細胞體外活化

黃 艷 王紅陽 郭繼芳 劉 颯 (華北煤炭醫學院附屬醫院呼吸內科,河北 唐山 063000)

目前認為腫瘤微環境中抗原提呈細胞及效應細胞是腫瘤微環境的關鍵細胞,可以發揮免疫監視及清除癌細胞的作用。近年來樹突細胞(DCs)作為抗原提呈細胞在機體的抗腫瘤免疫反應中的重要作用日益受到重視,對腫瘤浸潤樹突細胞(TIDC)的研究證實 DCs是腫瘤微環境中的主要抗原提呈細胞,但是無功能或功能低下。有關惡性胸水腫瘤微環境中的TIDC研究較少,目前對惡性胸水中的淋巴細胞的研究頗多,認為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)主要源于 T淋巴細胞,IL-2作用下可增殖、分化為細胞毒性 T細胞(CTL)。我們選擇在體外用IL-2活化惡性胸水免疫細胞,主要針對 TIL和 TIDC,觀察負載腫瘤全抗原后對腫瘤細胞的體外殺傷作用,以期為惡性胸水臨床免疫治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 多種氨基酸培養基(RPMI1640,美國Lifetechnologies公司)。淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque液,上海試劑二廠),IL-2(北京雙鷺生物工程制品廠),AB型血清(中國醫學科學院天津血液學研究所)。肝素抗凝試劑、人外周血 T細胞亞群 SAP法檢測試劑盒、S-100蛋白 SP法檢測試劑盒(北京中山生物技術有限公司)。

1.2 臨床資料 選取 2003年 3月至 2007年 8月我院診治的100例肺癌合并惡性胸水老年患者,男 50例,女 50例。所有病例經胸片、CT及病理學診斷和(或)細胞學檢查證實為晚期惡性肺腫瘤合并胸膜轉移致胸腔積液患者,同時血性胸水患者不作為研究對象。

1.3 方法 在無菌操作下抽取患者胸水 500 ml,并將其引流進含有肝素(10 U/ml)的無菌鹽水瓶內,50 ml離心管分裝胸水,1 000 r/min,20℃離心 10 min。棄上清,Hanks液洗 2遍。取 10只 10ml離心管各加淋巴細胞分離液 3.5 ml,以 1∶1的比例加入 HBSS懸浮的細胞,2 000r/min,20℃離心 20 min。吸取白膜層細胞轉移至 10ml離心管。1 000 r/min離心 10min。棄去上清,含滅活補體的 10%人 AB型血清的 RPMI1640培養基洗 2遍。調整細胞濃度為 106/ml接種于 6孔板中,每孔加2 ml,置體積分數為 0.05的 CO2、37℃溫箱中培養培養 2～3 h。輕輕吸取非貼壁細胞,輕輕洗去殘余懸浮細胞,獲得先貼壁細胞,所有懸浮細胞共同轉移至另一 6孔板中再貼壁 20 h,再次吸取非貼壁細胞(單核細胞為主)(包括TIDC和TIL)。非貼壁細胞中加入 500 U/ml IL-2,每 2天傳代 1次同時補充 IL-2,37℃ 5%CO2溫箱繼續培養,相差顯微鏡下觀察細胞形態。臺盼藍計數細胞并檢測細胞活性。細胞培養前后SP法檢測 T細胞亞群免疫功能及 S-100蛋白陽性細胞。S-100蛋白陽性細胞判定標準:光鏡下可見胞漿及胞膜出現棕黃色,陽性結果為棕黃色,樹突細胞胞漿著色,單核 /巨噬細胞染色位于細胞膜。

2 結 果

2.1 免疫組化DAB染色結果判定 陽性結果為棕黃色;光鏡下可見胞漿及胞膜出現棕黃色,S100陽性DC胞漿著色,單核/巨噬細胞染色位于細胞膜,見圖 1;活化第 7天:DC形態不規則,有長短、粗細不等的突起;核不規則,且多扭曲,胞漿內出現彌漫狀或顆粒狀棕黃色反應物;胞漿呈分枝狀突起,形似樹突狀,而巨噬細胞出現胞膜棕黃色,圖 1。

2.2 流式細胞儀分析鑒定DC表面分子 PEMCs培養前微量CD1a+DC,無DC。活化 TIDC 7 d:出現 CD1a+DC和 CD8+3DC,是 DC的成熟標記,見表 1。

圖1 TIDC光鏡下形態(DAB,×400)

表1 培養前后 DC細胞表型變化(±s)

表1 培養前后 DC細胞表型變化(±s)

與培養前比較:1)P＜0.01

時間點 CD1a+DC的比例 CD+83DC的比例培養前 0.19±0.14 0.00培養后 0.76±0.221) 0.62±0.191)

3 討 論

肺癌合并惡性胸水臨床常見,以胸膜轉移為常見原因,這些轉移灶從生物學角度看具有異質性,每個灶對抗腫瘤藥物的敏感性也存在異質性,單純化療除去所有轉移灶并不可能?？乖岢始毎麑⒛[瘤抗原有效地提呈給T淋巴細胞,激活腫瘤抗原特異性細胞毒性 T淋巴細胞(CTL)對腫瘤細胞的殺傷作用是特異性抗腫瘤免疫的關鍵環節〔1,2〕。DC是體內功能最強的專職抗原提呈細胞,DC僅占外周血單個核細胞總數的 0.5%～1.0%,癌腫瘤微環境DCs的數量、功能的研究鮮見報道,TIDC是腫瘤微環境中的主要抗原提呈細胞,可能是一種無功能或功能低下的 DC,腫瘤細胞在腫瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是導致 TIDC功能低下的原因之一,抑制免疫細胞的抗腫瘤免疫應答,研究 TIDC對了解腫瘤免疫逃避機制具有重要意義〔3〕。由于晚期癌癥患者全身免疫功能的低下,導致了癌性胸水中的TIL處于免疫抑制狀態。現 TIL體外活化后其特異性及細胞殺傷活性等已得到臨床證實,來自自體腫瘤細胞的TIL對自體腫瘤具有強大的細胞毒作用,對自體正常組織無殺傷性,著腫瘤免疫學的深入,提出了“腫瘤微環境”的概念,由于惡性腫瘤在患者體內生長時能分泌免疫抑制因子,抑制免疫細胞的抗腫瘤免疫應答。因此,如何解除腫瘤細胞的免疫抑制作用,優化機體的特異性抗腫瘤免疫的微環境,提高腫瘤患者機體自身的抗腫瘤免疫應答,是對癌細胞擴散和轉移的預防及治療過程中一個重要的問題。以往的研究發現,IL-2基因修飾的 DC免疫治療后,能優化荷瘤宿主體內抗原提呈的微環境,腔內直接注入TIL,對局部抗腫瘤免疫應答的微環境起到了優化和增強作用,能有效地抑制晚期癌癥患者胸水中癌細胞的增長。本文發現IL-2活化 TIL的同時,使胸水中的無功能 TIDC轉變為成熟DC,腫瘤抗原致敏的TIL和TIDC有特異性殺傷作用。本研究結果顯示惡性胸水中的TIDC數量極少,經過IL-2活化,T細胞免疫功能明顯上調,且對于腫瘤抗原具有特異性殺傷作用。本研究為惡性胸水的臨床治療提供了可靠的實驗依據,在臨床治療中將有廣闊的應用前景。

1 Michael RS.Dendritic cells presenting tumor antigen〔J〕.Cancer Immunol Immunother,1996;43(1):158-64.

2 Sallusto F,Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and down regulated by tumor necrosis factor alpha〔J〕.J Exp Med,1994;179(4):1109-18.

3 Canque B,Rosenzwaijg M,Camus S,et al.The effect of in vitro human immuo deficiency virus infection on dendritic cell differentiation and function〔J〕.JBlood,1996;88(11):4215-28.