CETP基因 D442G突變與高膽固醇血癥的相關性

張明明 帖彥青 馬 倩 宋光耀 孫海娟 郝志華 王俊明

(河北省人民醫院檢驗科,河北 石家莊 050051)

膽固醇酯轉運蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)是協調脂質轉運的重要蛋白,與血脂水平及血漿中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平、成分組成及顆粒的大小均密切相關〔1〕,在膽固醇的代謝中具有非常重要的作用。某些基因多態性可以改變CETP的活性及功能,對脂代謝產生影響,從而影響動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發生與發展。迄今發現的CETP多態位點至少包括啟動子區 11個、內含子 21個、外顯子 16個,其中以 D442G和R451Q最為常見。但迄今關于 CETP基因多態性與血清膽固醇水平的關系尚不完全明確,故本研究應用PCR-RFLP技術檢測 CETP基因 D442G突變在不同人群的基因頻率和基因型頻率,同時測定血清CETP濃度、血脂水平,探討 D442G突變與血漿膽固醇水平的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 730例膽固醇異常患者均來自我院體檢中心,排除了 LDL-R、ApoB100基因突變。按照 2007年“中國成人血脂異常防治指南”標準〔2〕,分為:(1)高膽固醇血癥組(HC組)446例,總膽固醇(TC)≥6.22 mmol/L(240 mg/dl)和甘油三酯(TG)＜1.7 mmol/L,其中男 290例,女 156例;年齡 36～58歲,平均(46.81±10.40)歲;(2)邊緣高膽固醇血癥組(BHC組)284例,5.18 mmol/L＜TC＜6.19mmol/L(200mg/dl＜TC＜239mg/dl)和 TG＜1.7 mmol/L,其中男 165例,女 119例,年齡34～59歲,平均(45.56±10.24)歲。同時收集對照組(NC組)187例,TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl),且 LDL-C＜3.12 mmol/L,其中男 100例,女 87例,年齡 35～59歲,平均(46.07±10.35)歲。血脂異常均為初次診斷,且未用任何降脂藥物。所有研究對象常規檢查均未發現異常,且所有受試對象均除外影響脂類代謝的疾病,排除應用影響糖脂代謝藥物者。

1.2 方法

1.2.1 一般指標 測量身高、體重、腰圍和血壓,計算體重指數(BMI)=體重(kg)/身高(m2)。

1.2.2 血脂測定 體檢人群過夜空腹 12 h,次日清晨抽取肘靜脈血,留取 4ml,置于促凝管中,分離血清,待測血脂;另取4 ml置于EDTA抗凝管中,-80℃低溫冰箱中保存,用于提取DNA。 TC、TG、HDL-C采用酶法測定,由 Beckman全自動生化分析儀測得,LDL-C按 Friedwald公式計算得出,LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.3 ELISA檢測 CETP濃度 CETP試劑盒E0814h由武漢晶美生物有限公司提供,最小可測人CETP濃度為 0.78 ng/ml;板內、板間變異系數均 ＜10%。依據試劑盒的說明書操作,測定血清中 CETP濃度。

1.2.4 CETP基因的多態性分析(PCR-RELF) (1)人基因組DNA的提取:EDTA抗凝血 400μl,按照天根 TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取基因組 DNA。(2)PCR擴增LDL-R基因目的片段:引物設計采用生物學軟件 Primer5.0,并與 GenBank進行比對。序列為:上游引物 5′-AGCAAAGGCGTGAGCCTCTCCG-3′,下游引物 5′-AGGAGGGAGCCAAGCTGGTAGA-3′。上游引物 P3設計時將其 3′端第 3個堿基設計為 C,而模板為 T,當 CETP基因第 1506位堿基由A突變為G時,就形成了 MspⅠ酶切位點,PCR產物長度179 bp。 PCR反應體系:共 20 μl,包括:KOD plus(5U/μl)0.5μl、上下游引物各 1 μl、基因組 DNA 1 μl、dNTP Mixture 1 μl、buffer 2μl、ddH2O 13.5 μl。 PCR反應采用降落聚合酶鏈反應技術,反應條件見文獻〔3〕。瓊脂糖電泳鑒定 PCR產物。(3)PCR反應產物的限制性片段長度多態性分析:PCR產物用限制性內切酶 MspⅠ進行酶切,反應體系共 20μl,包括 PCR擴增產物 5μl,限制性內切酶 1μl,Buffer 2μl以及雙蒸水。于37℃水浴酶切 4 h,加入 buffer 2μl終止反應。酶切產物經 8%聚丙烯酰胺凝膠(8%PAGE-Gel)電泳,100 mV,50 min,并與Marker比較,用 UVPGD-8000凝膠圖像分析系統鑒定,照相。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0軟件。計量資料采用±s表示,多組比較采用單因素方差分析,基因頻率采用基因計數法計算;組間基因型與等位基因頻率比較采用 χ2檢驗,Logistic回歸分析 CETP基因多態位點與血清膽固醇水平升高的關系。

2 結 果

2.1 三組血脂及CETP濃度的比較 三組年齡、性別均匹配,BMI在正常組、高膽固醇血癥組、邊緣高膽固醇血癥組依次升高,差異有統計學意義(均 P＜0.05),HDL在正常組、邊緣高膽固醇血癥組、高膽固醇血癥組依次降低,CETP濃度依次升高,差異有統計學意義(均P＜0.05),見表 1。

表1 三組血脂及CETP濃度的比較(±s)

表1 三組血脂及CETP濃度的比較(±s)

與 NC組比較:1)P＜0.05,與 BHC組比較:2)P＜0.05;表 2同

指標 NC組(n=187)BHC組(n=284)HC組(n=446)年齡(歲) 46.41±10.45 46.38±10.63 47.01±11.05 BMI(kg/m2) 23.76±2.34 25.14±3.021) 25.04±2.481)TC(mmol/L) 4.36±0.51 5.66±0.431) 7.99±0.781)2)TG(mmol/L) 1.02±0.31 1.09±0.31 1.10±0.37 HDL(mmol/L) 1.42±0.29 1.27±0.371) 1.09±0.361)2)LDL(mmol/L) 2.42±0.48 4.21±0.611) 5.47±0.791)2)CETP(mg/L) 1.65±0.78 2.18±1.211) 2.48±1.391)2)

2.2 CETP基因D442G突變基因型的判定

2.2.1 PCR-RFLP分型 根據限制性內切酶 Msp I的酶切情況,表現為DD基因型、DG基因型和 GG基因型。PCR產物為179bp,DD野生型因無酶切位點仍為 179 bp,DG雜合子為179bp和 159 bp兩個片段,GG突變純合子有 Msp I酶切位點,為 159 bp的 1條帶。見圖 1。

圖1 CETP基因第 15外顯子MspⅠ酶切后的電泳結果

2.2.2 DNA序列分析 經過酶切分型后,取 PCR產物進行測序。D442G突變是CETP基因第 15外顯子 1506位核苷酸發生A→G錯義突變,上游引物 3′端第 3位設計引入 T→C錯配堿基以形成 Msp I酶切位點(C↓CGG)。若為突變型(A→G)則有Msp I酶切位點。以上均經DNA測序證實了酶切分析的位點準確性。見圖 2。

圖2 CETP基因D442G突變的DNA測序結果

2.3 CETP基因D442G突變基因型和等位基因頻率分布 在對照組中未發現 D442G突變的純合子 GG型,而HC組和BHC組中均發現D442G突變的純合子GG型。三組D442G突變GG基因型及 G等位基因的分布差異有統計學意義(P＜0.05),HC組中 GG基因型及 G等位基因頻率明顯高于其余兩組(P＜0.05)。見表 2。

表2 CETP基因 D442G突變基因型和等位基因頻率分布〔n(%)〕

2.4 CETP基因D442G突變不同基因型間血脂與 CETP濃度比較 HC組 GG基因型者與 DG基因型、DD基因型比較,其血清 TC、HDL-C、LDL-C水平有逐漸下降的趨勢,CETP水平有逐漸上升的趨勢,其中 TC、CETP、LDL-C水平差異有統計學意義(P＜0.05),HDL-C水平在三組之間差異沒有統計學意義(P＞0.05)。BHC組和對照組 DG基因型的TC、LDL-C均高于DD基因型,CETP濃度低于DD基因型(P＜0.05),HDL-C水平高于 DD基因型(P＞0.05)。見表 3。

2.5 CETP基因D442G突變與HC的關系 以TC作為應變量(Y),以性別、年齡、BMI、TC、TG、HDL和 CETP基因 D442G基因型為自變量(X)進行多因素 Logistic回歸分析,發現 CETP基因 D442G突變 GG基因型(OR=2.60,95%CI 1.418～4.764,B=0.955,SE=0.309,Wald=9.552,P=0.002)是高膽固醇血癥的獨立危險因素。

表3 CETP基因 D442G突變不同基因型間血脂和CETP濃度的比較(±s)

表3 CETP基因 D442G突變不同基因型間血脂和CETP濃度的比較(±s)

與 DD基因型比較:1)P＜0.05,與 DG基因型比較:2)P＜0.05;與GG基因型比較:3)P＜0.05

指標 HC組(n=446)DD DG GG BHC組(n=284)DD DG GG NC組(n=187)DD DG GG TC(mmol/L) 7.31±1.20 11.1±0.931) 12.51±1.871)2) 5.88±0.23 6.17±0.021) - 4.23±0.30 4.77±0.021) -TG(mmol/L) 0.98±0.29 1.00±0.33 0.99±0.38 0.99±0.27 0.93±0.37 - 1.01±0.33 1.02±0.10 -HDL(mmol/L) 1.20±0.30 1.24±0.36 1.31±0.38 1.22±0.39 1.37±0.29 - 1.19±0.07 1.27±0.20 -LDL(mmol/L) 5.60±1.33 9.52±1.261) 10.86±1.911)2) 4.02±0.49 4.28±0.251) - 2.45±0.42 3.31±0.751) -CETP(mg/L)2.61±1.243) 2.46±1.223) 2.29±0.51 2.34±1.18 2.17±1.13 - 1.92±1.16 1.58±1.07 -

3 討 論

高膽固醇血癥可導致多種疾病,故與其相關的CETP基因研究也日益受到重視。CETP基因長度為25 kb,位于人類16號染色體長臂(16q12～21),包含 16個外顯子和 15個內含子〔4〕,編碼產物 CETP在膽固醇逆向轉運中起關鍵作用〔5〕。CETP影響 HDL和 LDL顆粒大小的分布,是參與 HDL代謝和決定HDL、LDL水平的重要因素〔6,7〕。CETP基因的改變將影響其蛋白水平的表達,從而影響脂質的代謝,進而對與脂質密切相關的疾病產生影響。

王永志〔8〕等研究發現在高膽固醇血癥患者中 CETP的濃度和活性有顯著變化,對脂代謝起到重要的調節作用。本研究CETP在高膽固醇血癥組與對照組有顯著性差異驗證了這一觀點。而且在本研究中 DD、DG、GG三種基因型 CETP的濃度也存在顯著差異,DD型純合子的CETP濃度明顯高于其余兩種基因型,提示CETP基因D442G基因突變影響 CETP的濃度和活性。

CETP基因的 D442G突變是第 15外顯子的錯義突變442Asp→Gly(D442G),即 cDNA第 1506位堿基 A→G轉換突變,導致第 442位天冬氨酸(Asp)被甘氨酸(Glv)替代。由于突變位點靠近脂質轉運活性中心,影響 CETP的合成及活性,D442G在降低CETP水平的同時,還能升高 HDL-C水平。有資料證實日本是目前 CETP基因缺陷最為頻發的國家〔9〕,中國人該基因變異頻率略低于日本〔10〕,但在歐美白種人和印度人未發現該基因突變〔11〕。故本研究對CETP基因的 D442G突變進行了分析,結果發現三組人群中 HC組和BHC組均檢出 CETP基因 D442G突變GG突變純合子,而在對照組中則未檢出,與鄭克勤〔12〕的研究結果一致;而 HC組 D442G突變頻率為 5.3%,與王偉〔13〕報道的突變率為 6%相接近。本研究還顯示 HC組中GG基因型及 G等位基因頻率明顯高于其余兩組。在 HC組中,GG基因型者血清 TC、LDL-C水平較其他兩組有上升趨勢,CETP水平有下降趨勢;回歸分析顯示高膽固醇的主要危險因素是 CETP基因 D442G突變GG基因型。以上都說明 CETP基因的D442G突變與高膽固醇血癥關系密切,但該突變如何調控膽固醇生成尚待進一步研究。

1 Sandhofer A,Tatarczyk T,Laimer M,et al.The TaqIB-variant in the cholesterylester transfer protein gene and the risk of metabolic syndrome〔J〕.Obesity(Silver Spring),2008;16(4):919-22.

2 中國成人血脂異常防治指南制定聯合委員會.中國成人血脂異常防治指南〔J〕.中華心血管雜志,2007;359(5):390-409.

3 王綠婭,曹守春,藺 潔,等 .降落聚合酶鏈反應技術在低密度脂蛋白受體基因點突變研究中的應用〔J〕.中華檢驗醫學雜志,2003;26(7):403-6.

4 Dullaart RP,Sluiter WJ.Common variation in the CETP gene and the implications for cardiovascular disease and its treatment:an updated analysis〔J〕.Pharmacogenomics,2008;9(6):747-63.

5 Barter PJ,Kastelein JJ.Targeting cholesteryl ester transfer protein for the prevention and management of cardiovascular disease〔J〕.JAm Coll Cardiol,2006;47(3):492-9.

6 Barter PJ,Brewer HB Jr,Chapman MJ,et al.Cholesterylester transfer protein:a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerosis〔J〕.Arterioscl Throm Vasc Biol,2003;23(2):160-7.

7 Wang J,Qiang H,Chen D,et al.CETP gene mutation(D442G)increase low-density lipoprotein particle size in patients with coronary heart disease〔J〕.Clin Chim Acta,2002;322(1-2):85-90.

8 王永志,鄢盛愷,宋耀虹 .漢族人膽固醇酯轉運蛋白 TaqIB基因多態性與 2型糖尿病的關系〔J〕.臨床檢驗雜志,2008;26(4):297-9.

9 Nagano M,Yamashita S,Hirano K,et al.Molecular mechanismsof cholesteryl ester transfer protein deficiency in Japanese〔J〕.J Atheroscler Thromd,2004;11(3):110-21.

10 Hsu LA,Ko YL,Hus KH,et al.Genetic variations in the cholesteryl ester transfer protein gene and high density lipoprotein cholesterol levels in Taiwanese Chinese〔J〕.Hum Genet,2002;110(1):57-63.

11 Dixit M,Bhattacharya S,Mittal B.Association of CETP TaqI and APOE polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in North Indians:a case control study〔J〕.BMC Endocr Disord,2005;5(1):7.

12 鄭克勤,張思仲,張克蘭,等.膽固醇酯轉運蛋白基因突變及其與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病易感性的關聯研究〔J〕.中華醫學遺傳學雜志,2003;20(11):23-6.

13 王 偉,周 新,劉 芳,等 .膽固醇酯轉運蛋白基因 TaqIB多態性、D442G突變與冠心病的相關性研究〔J〕.中華心血管病雜志,2004;32(11):981-5.