GHRP對心衰大鼠心功能及細胞因子的影響

宋漢君 田國忠 韓 曦 扈清云 王培軍 (佳木斯大學基礎醫學院解剖教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

慢性心力衰竭(CHF)是一種復雜的臨床綜合征,是多種心血管疾病發展的嚴重階段,且預后較差。研究表明,細胞因子的異常在 CHF的病理生理和發病機制中起重要作用〔1〕,其中內皮素-1(ET-1)在正常情況下含量較少,在 CHF發展過程中顯著升高,且與 CHF程度密切相關,并且是 CHF獨立的預后因素〔2〕。 21世紀國內外研究者提出 “心衰生物學治療”〔3,4〕的觀點。近年研究表明,生長激素釋放肽(GHRP)對心臟有較全面的保護作用。本研究通過觀測 CHF大鼠心功能、心肌細胞形態及 ET-1表達的變化,探討 GHRP的治療作用,以期為臨床治療 CHF提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康 Wistar大鼠 30只,由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 鹽酸阿霉素(ADR,浙江海正藥業股份有限公司);GHRP-2(上海超研生物科技有限公司);ET-1免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 隨機分為正常組、模型組和治療組,每組 10只。模型組第 2、4天腹腔注射(ip)ADR 1 mg/kg,第 6、8天 ip ADR 2 mg/kg,第 10、12天 ip ADR 3mg/kg,第 14、16天ip ADR 4mg/kg,第 17天取材。正常組 ip等體積生理鹽水;治療組 ip ADR同模型組,同時從第 10天起,每日尾靜脈注射 1次 GHRP-2 25μg/kg,第 20天取材。

1.2.2 心功能測定 ①動物稱重后用戊巴比妥鈉 ip麻醉;②氣管插管,在大鼠頸部暴露頸部氣管,將插管插入,并接小動物呼吸機;③頸外靜脈插管,頸部游離頸外靜脈,迅速向心導入插管,并通過導管注入肝素抗凝;④頸總動脈插管,在頸部分離頸總動脈,迅速向心導入插管,經換能器連接生理多導儀,描記相關血流動力學指標。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡觀察 心功能測定完成后,打開胸腔,左心室插管,沖洗,迅速取出心臟,吸去血跡,將心臟切成厚約 4～5 mm的塊狀組織后,固定。經水洗、乙醇脫水和二甲苯透明后浸蠟,包埋,切片。二甲苯透明,乙醇脫水,水洗。染色后,經水洗、脫水、透明,中性樹膠封固。在 400倍鏡下觀察心肌細胞形態變化。

1.2.4 免疫組織化學(IHC)法觀測心肌中 ET-1免疫陽性細胞平均光密度 按說明書采用親合素-生物素-酶復合物法(SABC)染色。使用 BI-2000醫學圖像分析系統檢測、分析數據。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.0統計軟件進行處理,數據均

2 結 果

2.1 心功能測定 各項心功能指標正常組均正常。模型組心率、動脈壓、心臟舒張期左室內壓最大變化速率均低于正常組,且差異顯著(P＜0.05)。治療組與正常組比較,左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內壓最大下降速率(-dp/dt-max)等均無顯著差異。見表 1。

2.2 心肌 HE染色光鏡觀察 正常組心肌結構清晰,肌纖維連接緊密,排列整齊,細胞質豐富均勻;模型組心肌細胞有不同程度的炎性細胞浸潤,受累較重的心肌細胞呈小灶狀或片狀壞死,肌纖維排列紊亂,細胞水腫,出現空泡樣變;治療組與正常組比較,心肌細胞變化不明顯。見圖 1。

2.3 心肌中 ET-1免疫陽性細胞平均光密度 各組心肌中ET-1表達的平均光密度,模型組(0.369±0.016)高于正常組(0.296±0.022)、治療組(0.310±0.020),且差異顯著(P＜0.05);而治療組與正常組比較,差異不顯著(P＞0.05)。

表1 各組大鼠心率、動脈壓等變化(±s,n=10)

表1 各組大鼠心率、動脈壓等變化(±s,n=10)

與正常組、治療組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 n 心率(次/min) 動脈壓(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)正常組 10 247.3±19.28 132.1±17.43 3 224.4±278.07 2339.8±182.06模型組 10 212.6±12.851) 106.5±15.981) 2 142.2±252.091) 1 482.9±210.021)治療組 10 220.3±14.94 121.4±10.91 3 084.7±275.96 2 152.1±242.35

圖1 各組心肌HE染色結果(×400)

3 討 論

近年來隨著心血管疾病發病率的升高,CHF的出現也呈上升趨勢。20世紀 90年代人們才逐漸認識到心肌重塑是心衰發生發展的基本機制,在這個過程中細胞因子起到重要作用。ET-1是主要由血管內皮細胞和心肌細胞等合成及分泌的一種活性多肽,具有正性肌力作用,通過激活原癌基因刺激生長,使心肌細胞肥大和增殖,心肌肥厚〔5〕。國內外研究顯示,ET-1在正常人血漿中的含量較低,但在CHF患者血漿中含量顯著升高〔6〕,與 CHF的嚴重程度密切相關〔7〕。 Margulies等〔8〕研究發現 CHF中 ET-1是一個敏感和特異的指標。因血漿中ET-1的來源較為廣泛,所以本實驗通過IHC法檢測心肌中 ET-1免疫陽性細胞的變化。結果顯示:心肌中 ET-1表達的平均光密度,模型組高于正常組、治療組。由此可見,心肌組織中的ET-1與CHF密切相關,并且參與到 CHF的發生、發展過程中。由于血流動力學改變,造成血管內皮細胞受損,血管內皮功能障礙,血管壁切應力改變、缺血缺氧、交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活和多種細胞因子的激活而導致 ET-1釋放增加。

本實驗研究顯示,治療組與模型組比較,動脈壓、心臟舒張期左室內壓最大變化速率明顯增加,與國內外的報道一致,說明 GHRP能夠通過調節血流動力學來改善心功能。心肌中ET-1表達水平下降,可能的機制:①GHRP通過 RAAS,降低血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)濃度,減少對心肌正常功能的損傷。②抑制 CHF大鼠應激激素的過度反應,降低ET-1的濃度。此外曹濟民課題組研究發現,GHRP既能增加心臟收縮,又能增加心臟的舒張,在心臟血流動力學方面作用明顯〔9〕。因而 GHRP能夠調控ET-1對心臟的作用。

目前國內外GHRP對CHF心臟作用的研究甚少。通過本研究顯示,GHRP能降低 ET-1的表達,改善心功能,以期為 CHF生物學治療藥物的研制和開發探索新思路,為臨床上應用 GHRP相關藥物治療CHF提供理論依據。

1 Mann DL.Recent insights into the role of tumor necrosis factor in the failing heart〔J〕.Heart Fail Rev,2001;6(1):71-80.

2 Pousset F,Isnard R,Lechat P,et al.Prognostic value of plasma endothelin-1 in patients with chronic heart failure〔J〕.Eur Heart J,1997;18(2):254-8.

3 Gheorghiade M,De Luca L,Bonow RO.Neurohormonal inhibition in heart failure:insights from recent clinical trials〔J〕.Am J Cardiol,2005;96(12):3-9.

4 Hsu JH,Yeh JL,Dai IK,et al.Increased circulating calcitonin gene-related peptide in congestive heart failure caused by congenital heart disease〔J〕.Int Heart J,2005;46(5):867-75.

5 Ram CV.Possible therapeutic role of endothelin antagonists in cardiovascular disease〔J〕.Am J Therapeutics,2003;10(6):396-400.

6 李 香,金 哲,崔 瑛,等 .慢性心力衰竭與血漿一氧化氮、內皮素及前列環素動態變化的關系〔J〕.中國老年學雜志,2008;28(14):1425-7.

7 李鐵志,張曉剛,潘麗麗,等 .血漿腦鈉肽和內皮素 1在心力衰竭患者中的濃度變化及相關性〔J〕.中國醫科大學學報,2008;37(1):105-6.

8 Margulies KB,Hildebrand FL Jr,Lerman A,et al.Increased endothelin in experimental heart failure〔J〕.Circulation,1990;82(6):2226-30.

9 Xu XB,Cao JM,Pang JJ,et al.The positive inotropic and calcium-mobilizing effects of growth hormone-releasing peptideson rat heart〔J〕.Endocrinology,2003;144(11):5050-7.