齊墩果酸對人早幼粒白血病 NB4細胞增殖的影響及其機制

李鴻梅 王敬春 齊占朋 王 睿 李雪巖 劉吉成

(齊齊哈爾醫學院中心實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

白血病的治療一直以化療為主,大多數化療藥物都通過誘導細胞凋亡來達到消滅腫瘤細胞的目的,但是化療藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時對機體正常細胞的毒性作用也不容忽視。此外,腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥,也使化療的療效大大降低,甚至導致化療失敗。因此,從天然藥物中尋找既可提高治療效果又能減少對機體副作用的抗腫瘤活性成分,是當今抗腫瘤藥物發展的主要方向之一。齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種天然來源的藥物,廣泛存在于植物中,以游離或結合成苷的形式存在。近年來,人們發現 OA可以通過多種機制抑制肝癌、結腸癌、肺癌和順鉑耐藥胃癌細胞增殖〔1～5〕,但是 OA對體外培養的人早幼粒白血病(M3型)NB4細胞的作用未見報道。本實驗以 M3型白血病 NB4細胞為研究對象,以不同劑量的OA處理,觀察其對細胞增殖的影響及其對凋亡相關基因Bcl-2及 Bax基因表達的影響,以探討OA抑制細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 M3型白血病細胞株 NB4(中國科學院上海細胞庫);OA(中國藥品生物制品檢驗檢定所)。OA用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成 80 mmol/L的原液,-20℃儲存;用含10%小牛血清 RPMI-1640培養基稀釋成不同濃度的工作液。RPMI-1640和小牛血清(Gibco);SYBR ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time,TaKaRa公司)。

1.2 NB4細胞的培養 細胞常規培養在 RPMI-1640培養基中,用滅菌的 5.6%NaHCO3溶液將培養基的 pH調至 7.2,每100ml培養基含青霉素 1萬 U,鏈霉素 10mg、小牛血清 10 ml。細胞置于 CO2孵箱,37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養。為避免由于細胞密度過大而給細胞生長和生存帶來的可能的影響,每天通過增加新鮮的培養基來調整細胞密度,使細胞密度不超過 5×105個/ml。

1.3 OA對NB4細胞增殖的影響 取對數生長期的 NB4細胞,將細胞轉移至 15 ml的離心管中,1 000 r/min離心 10 min,用新鮮的含 10%小牛血清的 RPMI-1640培養基將細胞密度調整為 5×104個/ml的細胞懸液后,將細胞接種于 3塊 96孔培養板。每孔加細胞懸液 200μl(1×104個細胞),然后加入OA,使其終濃度分別為 40、60、80和 100μmol/L,每毫升細胞培養液中 DMSO不超過 50μl。每個濃度均設 3個平行孔,調零孔不加 NB 4細胞懸液,只加含 10%小牛血清的 RPMI-1640。細胞分別培養 24、48和 72 h。實驗終止前 4 h每孔加入 5 mg/ml的 MTT磷酸鹽緩沖液 20μl,同樣條件下繼續培養 4 h,終止培養。1 000 r/min離心 10 min,棄上清。每孔再加入 DMSO 200μl,振蕩 10min后,用酶標儀在波長 570 nm處測定吸光度值。按下面公式計算細胞生長抑制率(IR,%)=(1-實驗孔OD570/對照孔 OD570)×100%。

1.4 實時熒光定量 PCR檢測 NB4細胞 Bcl-2、Bax mRNA表達

100μmol/L OA處理細胞 72 h后,用 RNAiso Reagent(TaKa-Ra公司)抽提細胞總 RNA。按 RNAiso Reagent操作說明書進行。紫外分光光度計分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的含量、純度及完整性。

引物由 TaKaRa公司設計合成,序列如下:Bcl-2:上游,5′-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3′;下游,5′-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3′,產物長度 116 bp;Bax:上游 ,5′-AGA CAC CTG AGCTGA CCT TGG AG-3′;下游 ,5′-GTT GAA GTT GCC ATCAGCAAA CA-3′,產物長度 197 bp。 β-actin上游:5′-AAG AGA GGC ATC CTG ACC CT-3′;下 游:5′-TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA-3′,產物長度 218 bp。逆轉錄反應:在 2700型 PCR System擴增儀上按 SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit反轉錄試劑說明書進行 cDNA的合成,反應參數為:反轉錄反應 37℃15 min,反轉錄酶的失活反應 85℃ 5s。

PCR反應采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit試劑,在 ABI7300熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司)上進行PCR反應。設置檢測文件,反應條件:95℃預變性 10 s;PCR反應,95℃變性 5 s,60℃退火 31 s,共 40個循環。整個過程中收集熒光,反應結束后,使用 Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析 PCR過程各檢測樣

本的 Ct值,Ct值隨模板濃度增大而減少。由融解曲線判斷PCR反應的特異性。用 2-△△Ct方法進行相對定量分析〔7〕。分別擴增目的基因和內參,每樣本作 3個復孔,得到兩組 Ct平均值。 △Ct實驗組=Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參, △Ct對照組=Ct對照組目的基因-Ct對照組內參,△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組,目的基因的表達差異以 2-△△Ct表示。

2 結 果

2.1 OA對 NB4細胞的生長抑制作用 見表 1。

表1 OA對NB 4細胞增殖的影響(±s,n=3)

與對照組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 24 h OD570 IR(%)48 h OD570 IR(%)72 h OD570 IR(%)對照組 1.55±0.02 - 1.51±0.02 - 1.46±0.03 -40μmol/L組 1.61±0.02 -3.87 1.44±0.04 4.64 1.26±0.021) 13.70 60μmol/L組 1.27±0.051) 18.06 0.97±0.031) 35.76 0.77±0.021) 47.26 80μmol/L組 1.02±0.021) 34.19 0.92±0.041) 39.07 0.69±0.031) 52.74 100μmol/L組 0.95±0.031) 38.71 0.76±0.021) 49.67 0.55±0.031) 62.33

2.2 OA對 NB4細胞 Bcl-2和 Bax mRNA表達的影響

2.2.1 OA對NB4細胞 Bcl-2 mRNA表達的影響 Bcl-2基因的擴增曲線和融解曲線見圖 1和圖 2。100μmol/L OA處理NB4細胞 72h后 Bcl-2mRNA的表達見表 2,與對照組相比,OA處理組 Bcl-2 mRNA表達下降 60%,差異有顯著性(P＜0.05)。

表2 兩組細胞中 Bcl-2基因表達相對值比較(±s,n=3)

表2 兩組細胞中 Bcl-2基因表達相對值比較(±s,n=3)

組別 Ct Bcl-2 Ctβ-actin △Ct △△Ct 2-△△Ct對照組 20.63±0.49 17.80±1.01 2.83±0.54 0.00±0.54 1.05±0.36實驗組 19.86±0.19 15.77±0.14 4.09±0.33 1.26±0.33 0.42±0.091)

圖1 Bcl-2基因的擴增曲線

圖2 Bcl-2基因的融解曲線

2.2.2 OA對 NB4細胞Bax mRNA表達的影響 Bax基因的擴增曲線和融解曲線見圖 3和圖 4。100μmol/L OA處理 NB4細胞 72h后Bax mRNA的表達見表 3。與對照組相比,OA處理組 Bax mRNA表達升高 81%,差異有顯著性(P＜0.05)。

圖3 Bax基因的擴增曲線

圖4 Bax基因的融解曲線

表3 兩組細胞中 Bax基因表達相對值比較(±s,n=3)

表3 兩組細胞中 Bax基因表達相對值比較(±s,n=3)

組別 Ct Bax Ctβ-actin △Ct △△Ct 2-△△Ct對照組 28.49±0.07 17.16±0.26 11.33±0.23 0.00±0.23 1.01±0.16實驗組 26.16±0.16 15.69±0.30 10.47±0.21-0.86±0.21 1.83±0.261)

3 討 論

本實驗發現,不同濃度的 OA對體外培養的人早幼粒白血病NB4細胞增殖的影響不同。當OA的濃度為 40μmol/L時,作用 24 h,對 NB4細胞的增殖并沒有抑制作用;作用 48 h,抑制率僅為 4.64%,與對照組比較差異不顯著;作用 72 h,OA對NB4細胞增殖抑制率達 13.70%,與對照組比較有顯著性差異。當OA的濃度達到 60μmol/L及以上時,OA則以劑量和時間依賴的方式抑制 NB4細胞的增殖。半胱氨酸蛋白酶家族(caspases)以瀑布的方式活化后產生級聯效應在細胞凋亡過程中發揮重要作用〔6〕。細胞凋亡的外部途徑即死亡受體途徑由腫瘤壞死因子家族啟動,當 caspase-8被募集到死亡受體復合物時,該凋亡途徑即被激活。Bcl-2蛋白家族對細胞凋亡的線粒體途徑即內部途徑起重要的調節作用。Bcl-2基因家族成員分為兩類:Bcl-2類為凋亡抑制因子,包括Bcl-2、Bcl-xl和 Bcl-w等;Bax類為凋亡促進因子,包括 Bax、Bak和 Box等。當凋亡抑制因子中的 Bcl-2和 Bcl-xl過表達時,可阻止細胞色素 C從線粒體釋放及 caspases的活化,從而抑制凋亡〔7〕。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡因子,該分子常常形成自身二聚體,或與Bcl-2/Bcl-xl形成二聚體,游離 Bax或 Bax同型二聚體水平升高可促進凋亡〔8〕。Bcl-2已經成為藥物抗性機制研究的主題,因為 Bcl-2能抑制化療藥物誘導的細胞凋亡〔9〕。

本實驗結果表明,100μmol/L OA處理 NB4細胞 72 h后,細胞凋亡相關基因 Bcl-2以及 Bax的表達均發生明顯變化,表現為抗凋亡的 Bcl-2基因表達下調,而促凋亡的 Bax基因表達上調,OA對NB4細胞增殖的抑制作用可能是通過上調 Bax基因的表達以及下調 Bcl-2基因的表達而實現的;OA可能通過線粒體途徑而誘導 NB4細胞發生凋亡。本研究為臨床白血病的化療和天然抗腫瘤藥物的開發提供了堅實的依據。

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6 Konopleva M,Zhao S,Xie Z,et al.Apoptosis.Molecules and mechanisms〔J〕.Adv Exp Med Biol,1998;457:217-36.

7 Kornblau S,Konopleva M,Andreeff M.Apoptosis regulating proteins as targets of therapy for hematological malignancies〔J〕.Expert Opin Investig Drugs,1999;8(12):2027-57.

8 Oltvai ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell,1993;74(4):609-19.

9 Yang E,Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis:a discourse on the BCL2 family and cell death〔J〕.Blood,1996;88(2):386-401.