天花粉蛋白抑制 Hela細胞增殖的臨床作用

李 軍 楊慧玲 (鄭州大學第一附屬醫院藥學部,河南 鄭州 450052)

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是從葫蘆科植物栝樓的塊根中提取的一種蛋白質,為我國傳統中藥“天花粉”的有效成分,具有引產、抗腫瘤和抗免疫缺陷病毒(HIV)等多種生物學功能〔1,2〕。TCS屬于單鏈核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在其引起細胞凋亡及相關基因表達方面。本文觀察 TCS對宮頸癌 Hela細胞增殖的抑制作用,從細胞自噬的角度探討TCS的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞株Hela細胞購自武漢大學典藏中心,用含 10%小牛血清的 DMEM培養基(Gibco公司),在 5%CO2、37℃條件下培養,每 3d傳代 1次。取對數生長期細胞進行實驗。TCS為江蘇天晴制藥總廠產品,Beclin1和微管相關蛋白輕鏈 3(LC3)抗體購自美國 Santa Cruz公司,異硫氰酸熒光素(FITC)標記的IgG購自武漢凌飛公司,膽囊收縮素(cell counting kit,CCK-8)試劑盒由日本 Dojindo Laboratories生產;其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測 TCS對 Hela細胞增殖的抑制作用 取對數生長期 Hela細胞接種于 96孔板上(細胞數為每孔 1×105個),待細胞貼壁分別加入不同濃度的TCS,每個濃度設 6個復孔,對照組加入相同體積的培養液,繼續培養 24、48、72 h,每孔加入 10μl CCK-8試劑,于 37℃、5%CO2培養箱孵育 1h,使用酶標儀檢測 450 nm波長處吸光度值(A),以空白對照孔調零,按下列公式計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率 =(A對照組-A實驗組)/A對照組。

1.2.2 單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色檢測細胞自噬變化選擇抑瘤效果明顯的藥物濃度 80μg/ml分別給藥 3、6、12、24 h,使用含 MDC(0.05mmol/L)的新鮮培養基孵育 15 min,離心洗滌 2次后涂片,使用熒光顯微鏡加 356 nm發射濾片和545nm斷濾片進行觀察、攝片。

1.2.3 Western印跡檢測細胞 Beclin1和LC3的表達 對數生長期 Hela細胞接種于 6孔板上,待細胞貼壁后加入 80μg/ml TCS,同時設立陰性對照,培養不同時間(0～24 h),用蛋白裂解液提取胞漿蛋白,考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠,每孔上樣量 100μg,常規電泳、轉膜、封閉,37℃封閉 1 h,加入 Beclin1(1∶1 000)和 LC3抗體(1∶500)4℃孵育過夜,堿性磷酸酶標記二抗(1∶3 000),室溫孵育 2 h,堿性磷酸酶染色 5 min,暗室內 X光膠片曝光顯影。圖像應用 TotalLab2.0軟件進行灰度分析并進行統計學處理。1.3 統計學處理 應用 SPSS13.0統計軟件,數據以±s表示,組間比較采用t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1 TCS對 Hela細胞的生長抑制作用 結果顯示TCS能夠顯著抑制 Hela細胞的生長,且此作用呈現明顯的時間和劑量依賴性。見表 1。

表1 TCS對Hela細胞生長的抑制率(%)

2.2 細胞自噬的形態學改變 TCS(80μg/ml)作用 3 h后,可見綠色點狀熒光顆粒散布于細胞的胞質內,這一效果一直持續到 24h后,且在給藥 6 h后自噬囊泡的數量最多,對照組則無此現象。

2.3 Beclin1和 LC3蛋白的表達 在 TCS分別作用于 Hela細胞 0、3、6、12、24 h后自噬特異性蛋白 Beclin1的相對灰度值為0.29±0.03、1.21 ±0.15、2.11±0.24、0.97 ±0.17、0.65 ±0.04;LC3相對灰度值為 0.35±0.02、1.28±0.11、2.18±0.21、1.05±0.19、0.61±0.06。差異均有統計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

自噬是一種從酵母到人類都存在的、高度保守的細胞行為,真核細胞借此來維持細胞生物合成和分解代謝之間的動態平衡,這一過程在清除細胞內衰老的蛋白、細胞器及細胞器的構建中起到重要作用,并與多種疾病和腫瘤的發生、發展密切相關〔3〕。TCS的抗腫瘤作用機制主要表現為誘導細胞凋亡、抑制細胞蛋白質的合成及促進自然殺傷(NK)細胞的活性等方面〔4〕,通過觀察自噬是否參與了 TCS對 Hela細胞的生長抑制作用,可更好地闡明TCS的抗腫瘤作用機制。

本實驗中使用 TCS處理人宮頸癌細胞株Hela細胞,CCK-8結果顯示TCS可顯著抑制 Hela細胞的增殖,且此作用呈現明顯的時間和劑量依賴性;MDC熒光染色結果顯示 TCS給藥后3 h可誘導Hela細胞發生自噬,這一效果一直持續到 24 h后。Beclin1是酵母 ATG6基因在哺乳動物中的同源類似物,位于人類染色體 17q 21上,是自噬信號通路上第一個被確認的腫瘤抑制分子〔5〕;LC3是酵母 ATG8在哺乳動物中的同源類似物,其脂質修飾形式位于自噬泡膜的表面,現已作為自噬的特異性標記蛋白〔6〕。Western印跡結果顯示,TCS作用 Hela細胞 3 h后自噬特異性蛋白 Beclin1和 LC3水平顯著升高,這一水平一直持續到 24 h后。這一結果說明,TCS能夠誘導 Hela細胞自噬水平的提高,且自噬活化與 Beclin1和 LC3蛋白的激活有關。在以后的研究中需要對自噬在這一過程的作用進行進一步的研究,以便為可能開發以自噬為基礎的宮頸癌治療藥物提供新的方向。

1 Shaw PC,Chan WL,Yeung HW,et al.Minireview:trichosanthin-a protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Life Sci,1994;55(4):253-62.

2 Shaw PC,Lee KM,Wong KB.Recent advances in trichosanthin,a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Toxicon,2005;45(6):683-9.

3 Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease〔J〕.Cell,2008;132(1):27-42.

4 張 茹,黃利鳴,岑暢飛.天花粉蛋白作用機制研究進展〔J〕.時珍國醫國藥,2009;20(12):3116-7.

5 Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1,an autophagy gene essential for early embryonic development,is a haploinsufficient tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2003;100(25):15077-82.

6 Galluzzi L,Aaronson SA,Abrams J,et al.Guidelinesfor the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes〔J〕.Cell Death Differ,2009;16(8):1093-107.