腫瘤多藥耐藥性產生機制及其逆轉的研究現狀

巫蒙 王梅

腫瘤是機體遺傳和環境致癌因素以協同序貫的方式使局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，包括多個癌基因的活化與抑癌基因的二次失活，是正常細胞不斷增生轉化所形成的新生物。腫瘤的發生是一個長期多階段多基因改變累積的過程，具有基因控制和多因素調節的復雜性[1]。

在腫瘤治療中，手術治療、放療、化療是最傳統的3種治療方案，其中化療占據著不可替代的重要地位。有些腫瘤在經歷了最初有效化療后，仍難免復發，這其中一個很重要的原因就是腫瘤細胞對化療藥物產生了多藥耐藥性。合理的聯合化療雖能最大限度發揮細胞毒作用，但都可因多藥耐藥(Multidrug Resistance,MDR)的出現而宣告失敗。MDR是指腫瘤細胞接觸一種抗腫瘤藥物后，產生對多種結構不同的、作用機制各異的其他抗腫瘤藥的耐藥性。MDR是目前腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的最重要的細胞防御機制，涉及臨床常用的多種抗腫瘤藥物，是腫瘤成功化療最嚴重的障礙之一，白血病、多發性骨髓瘤、食管癌、乳癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、腎癌、子宮癌、腦瘤、纖維肉瘤、神經母細胞瘤以及宮頸癌等面臨嚴重的MDR問題。因此研究MDR的發生機制并找到MDR逆轉方向，可以提高腫瘤化療效果。近年來，隨著對腫瘤藥物治療的進一步研究，探索腫瘤細胞多藥耐藥的機理并加以有效逆轉，已成為腫瘤研究領域急待解決的問題。

1 腫瘤細胞多藥耐藥的產生機制

MDR現象是Biedler[2]在1970年首次發現，之后國內外對MDR進行了廣泛而深入實驗與臨床研究，目前研究腫瘤耐藥機制主要是從MDR基因表達的產物入手，探討此類產物引起的耐藥機制。目前認為可能有以下幾種原因。

1.1 MDR基因及P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)

MDR基因在人類有二種：MDR1和MDR2，其中MDR1與腫瘤的多藥耐藥有關，MDR2的功能不清楚，但MDR1和MDR2基因序列具有較高的同源性。人類MDR1基因位于第7號染色體長臂上，含有28個外顯子，內含子與外顯子交界符合經典的APG配對，全長為4.5kb，含有一個開放讀框，編碼1280個氨基酸多肽，經糖基化后形成170kU的P-gp。它屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族成員之一，由兩個同源部分組成，每個部分都包含6個疏水跨膜區和1個具有高度保守ATP結合位點的親水區，親水區可能含有2個核苷酸結合位點，而疏水區則含有多個與MDR有關的藥物結合位點[3]。P-gp還具有能量依賴性“藥泵”功能，其能將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，使得細胞內化療藥物達不到有效作用濃度而產生耐藥性。這種由P-gp介導的多藥耐藥稱為典型多藥耐藥。

何楊[4]等研究發現P-gp的過度表達可能參與了乳腺癌的原發耐藥機制。MDR1基因及蛋白表達產物P-gp高表達臨床上與腫瘤化療耐藥復發和預后密切相關。現在認為P-gp作用機制是[5]：當抗癌藥進入胞漿膜，被識別并外排，當具有疏水結構域的抗癌藥彌散通過胞漿膜時，遇到兩側擴散來的多藥耐藥運載體，運載體利用兩個ATP結合位點上的能量將藥物泵出細胞外，胞膜胞漿中產生的疏水代謝產物作為轉運體的潛存底物，且這種通路不止一條。化療及其他藥物單一的長期治療激活了P-gp的功能，使得藥物在細胞內積蓄減少，從而產生了腫瘤的多藥耐藥。

1.2 拓撲異構酶Ⅱ(topoiso2merase,Tope)

DNA拓撲異構酶(Topo)是在DNA復制、轉錄和染色體分離中起重要作用的核酶。許多化療藥物以TopoⅡ為靶點，干擾基因正常的斷裂重接過程，導致基因破壞和靶細胞的死亡。腫瘤細胞內TopoⅡ表達水平下降，使腫瘤對抗腫瘤藥物敏感性下降，可引起腫瘤細胞的耐藥。在對93例SCLC化療患者進行的Ⅲ期臨床研究中[6]，研究者用免疫組織化學法對支氣管鏡活檢組織中拓撲異構酶－Ⅱ的表達情況進行了分析，發現拓撲異構酶-Ⅱ的表達水平與化療有效率有關，高表達的肺癌患者生存率明顯高于低度或中度表達者。李占文[7]等采用免疫組化法對78例術前未行化療患者的乳腺癌組織切片中TopoⅡ的表達進行分析，發現TopoⅡ的陽性表達率為73.1%，據此認為TopoⅡ的表達與乳腺癌MDR有一定關系。乳腺癌組織的原發MDR與TopoⅡ的表達有關,化療前對它們進行檢測可為化療藥物的選擇及預后判斷提供參考依據。

1.3 細胞凋亡(programmed cell death)

腫瘤細胞對凋亡的耐受是MDR的重要機制之一，近來研究表明多數細胞毒制劑通過誘導凋亡來殺傷細胞治療腫瘤，研究發現細胞凋亡相關基因如bcl-2，突變P53等的過度表達與腫瘤的發生有關，細胞凋亡相關基因為耐藥的靶分子，可與其他途徑共同介導[8]。

1.4 多藥耐藥相關蛋白基因(multidrug resistance associate protein,MRP)

Cole等[9]在研究小細胞肺癌耐藥株H69AR(對阿霉素耐藥)過程中發現MRP基因。近年來Kruh等[10]從白血病耐藥細胞株HL60R中所獲得的MRP2cDNA裝入到人pCEV27噬菌體質粒嵌合體中，再轉染NIHP3T3細胞，用MTT法檢測發現阿霉素50%抑制濃度IC50在轉染后的細胞較轉染前升高2.7倍，對與阿霉素結構不同的長春堿、足葉乙甙也產生耐藥，可知MRP直接參與MDR。楊波[11]等通過檢測MRP蛋白的表達, 發現SACC/DDP細胞的細胞漿中以及細胞膜上MRP蛋白的表達率很高可能是涎腺腺樣囊性癌細胞產生多藥耐藥的機制所在。目前研究認為MRP耐藥與mdr-1的基因3擴增、mRNA和p-170膜蛋白（p-gp）表達升高有關，MRP可識別化療藥物，并與之形成耦合物，導致細胞內藥物濃度降低或分布改變，而發生腫瘤耐藥。

1.5 蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)

PKC是一種鈣磷脂依賴性蛋白激酶，參與細胞內生物信息傳遞，表達與P-gp的功能有密切關系。具有MDR表型的腫瘤細胞中， PKC可通過促進P-gp的磷酸化增強其藥泵功能，導致MDR的產生。最近研究發現PKC抑制劑可以抑制胃癌細胞中P-gp的表達和逆轉其耐藥性，促進腫瘤細胞的凋亡，可能對MDR1的表達有調節作用[12]。

1.6 caveolin

caveolin是細胞膜呈歐米伽（Ω）樣內陷的微結構，直徑約為50～100nm。caveolin可以從細胞膜上分離出來，形成細胞質內的膜小體。caveolin是特化的細胞膜微結構域，它由其特異性的被覆蛋白caveolin及多種脂類分子和膜蛋白組成，在細胞外分子的內化、信號的跨膜轉導和膽固醇的轉運過程中起著重要的作用。新近的研究表明，caveolin及其某些組成成分在腫瘤多藥耐藥細胞中表達上調，并有可能參與了腫瘤細胞多藥耐藥性的形成。研究顯示，長春堿誘導耐藥的卵巢癌細胞skvlb1和紫杉醇誘導耐藥的肺癌細胞 A549-T24顯著上調了caveolin-1的表達[13]。

2 逆轉MDR的方法

腫瘤細胞對抗癌藥物產生多藥耐藥性，已經成為腫瘤治療失敗的主要原因之一。目前對逆轉劑的認識不是要不要的問題，而是處于什么腫瘤耐何種藥物，用什么逆轉劑和怎么用？臨床根據耐藥機制，注意3個方面：腫瘤類型、何種藥物耐受、毒副反應。

現階段主要針對如何抑制mdr-1的編碼產物P-gp。P-gp抑制劑作為逆轉的一種方法，已經被廣泛深入的研究。腫瘤細胞過量表達P-gp導致多藥耐藥是目前腫瘤化療的一大障礙，使用多藥耐藥逆轉劑與抗癌藥物聯合化療是克服臨床腫瘤MDR的重要方法。同時，人們也在開展針對其他機制來逆轉腫瘤的多藥耐藥性。

2.1 MDR化學逆轉劑

具有抑制藥物轉運泵功能，MDR逆轉劑的應用無疑是解決MDR的一種常用方法。

2.1.1 P-gp抑制劑

P-gp抑制劑作為逆轉的一種方法，已經被廣泛深入的研究了二十多年，根據它們的特點，可將其分為三代[14]。研究者們運用結構－活性關系和組合化學的方法，針對特異性機制，開發出了在低于抑制P-gp的濃度下，具有逆轉活性的逆轉劑。

2.1.2 環孢霉素A及其類似物

無免疫抑制作用的環孢霉素A衍生物西羅莫司(SDZPSC833)在體內外能夠逆轉MDR1基因的表達，阻止MDR克隆的形成，國外已將該藥用于難治性白血病和實體瘤的臨床研究[15]。趙春亭[16]在國內首先用環孢霉素A臨床逆轉一例難治性急性髓細胞白血病患者的多藥耐藥，使患者獲完全緩解，MDR細胞消失，說明MDR逆轉成功。初步研究發現環孢霉素A可提高該患者白血病細胞內柔紅霉素的濃度，繼而將CsA與人白血病MDR細胞系K_(562)／AO2共同培養，細胞內藥物濃度的動態觀察提示，K_(562)／AO2細胞與CsA共同培養后，可使DNR進入增多、排出減少，DNR的細胞內濃度提高，K_(562)／AO2細胞對DNR的敏感性提高了3.2倍。環孢霉素類藥物逆轉耐藥的機理不完全清楚，比較公認的是P170-MDR學說：多數學者認為環孢霉素類藥物是一種高度親脂類藥物，它與抗癌藥竟爭P170的結合位點，從而抑制其跨膜泵作用，使抗癌藥的外排降低，提高細胞內抗癌藥濃度而逆轉耐藥。

2.1.3 蛋白激酶抑制劑

蛋白激酶(PKC)可以改變藥物在MDR細胞中的蓄積，在一些MDR的腫瘤細胞PKC的活性增加，推測抑制PKC的活性可以對抗MDR的發生。

2.2 基因治療逆轉MDR

近年來，國內外開始將反義技術應用于腫瘤耐藥性逆轉的研究。根據堿基互補原理，設計出能特異地同相應靶基因結合的RNA或DNA，影響靶基因的轉錄和翻譯，以達到特異抑制靶基因表達的基因調控技術，包括反義RNA(antisenseRNA)技術，反義DNA(antisenseDNA)技術，又稱核酶(ribozyme)技術。

報道比較多的技術有MDRl基因的反義寡聚脫氧核糖核酸(AOD)，MDRl基因的反義RNA，切割MDRl mRNA的核酶外源性基因植入等技術。近幾年，siRNA介導的基因干擾技術又為多藥耐藥基因治療研究提供了一個全新的技術平臺。siRNA可以通過特異性抑制MDR1編碼的Mrna，使得P-gp的表達水平下調，從而達到耐藥逆轉的效果[17]。樸瑛等[18]構建ZNRD1基因的小干擾RNA載體并將其轉導入HL-60/VCR細胞，研究發現小干擾RNA真核表達載體能在一定程度上逆轉白血病細胞的耐藥性。彭智等[19]對具有典型多藥耐藥特征的慢性髓樣白血病急變細胞系細胞進行研究并設計了3條siRNA，研究結果表明3條siRNA都有不同程度的逆轉多藥耐藥的作用。上述結果肯定了特異性siRNA能夠有效抑制MDR-1編碼的糖蛋白的表達，提示siRNA有望成為逆轉耐藥的有效手段。根據腫瘤細胞多藥耐藥的機制,還可針對其他許多耐藥途徑設計siRNA,但仍在研究和論證之中。

腫瘤壞死因子-α具多種生物學效應，能直接抑制或殺滅多種腫瘤細胞，并能通過抑制mdr-1基因的機制逆轉MDR，但其具有的嚴重廣泛的毒性作用大大限制了它的臨床應用[20]。郭偉劍[21]采用基因治療的方法，將外源性Tnf-α基因導入腫瘤細胞，使腫瘤局部高濃度持續表達外源性Tnf-α基因，局部發揮其生物學效應，則可解決這一問題，其采用逆轉錄病毒介導Tnf-α基因轉染耐藥細胞，觀察外源性Tnf-α基因的導入對耐藥細胞的抑制及耐藥性逆轉作用。基因治療目前尚處于實驗室研究階段，在進入臨床試驗前尚需解決許多問題。

3 展望

當然，腫瘤多藥耐藥是一個復雜的問題，涉及基礎和臨床研究的許多方面，也存在如判定MDR尚無統一標準，MDR的各項檢測指標有待進一步研究，逆轉劑在體內難以達到體外有效逆轉濃度等一些問題。MDR的機制相當復雜，不同腫瘤細胞對同一種藥物可能有不同耐藥機制，而同一腫瘤對一種藥物也可能產生多種耐藥機制，耐藥甚至可能涉及到全身多系統多組織，單獨針對P-gp不能解決全部問題。正是如此，腫瘤的多藥耐藥對臨床用藥的重要性、耐藥逆轉劑的研究已成為熱點課題。隨著高效低毒逆轉劑和更加合理的抗腫瘤MDR藥物的不斷發現并逐步用于臨床，在單克隆抗體技術等基因水平逆轉MDR的探索、多靶點治療藥物、分子靶向藥物在腫瘤治療中的應用,根據腫瘤細胞多藥耐藥的機制，還可針對其他許多耐藥途徑設計siRNA，但仍在研究和論證之中。有理由相信不久的將來腫瘤對抗癌藥物的耐受性會逐漸被克服, 使腫瘤的治療取得突破性的進展。

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