基于電化學(xué)的血清蛋白-鉛絡(luò)合物的絡(luò)合及其解離

梁 瑩 ,潘 銳 ,魏學(xué)鋒 ,周 鳴 ,董鐵有

(河南科技大學(xué)a.化工與制藥學(xué)院;b.第三附屬醫(yī)院;c.環(huán)境工程研究所,河南洛陽(yáng) 471003)

0 前言

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外關(guān)于鉛污染及鉛危害人體(特別是兒童)的報(bào)道越來(lái)越多[1]。鉛是屬于持久性污染物,在自然環(huán)境中不能為生物代謝所分解。鉛對(duì)于人體內(nèi)的大多數(shù)系統(tǒng)均有危害,特別是損傷骨髓造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟。鉛進(jìn)入人體后,除部分通過(guò)糞便、汗液排泄外,其余在數(shù)小時(shí)后溶入血液中,阻礙血液的合成[2]。

血清蛋白是血漿里最豐富的蛋白質(zhì),具有儲(chǔ)存和載運(yùn)功能[3]。血清蛋白普遍存在于血液中并且容易被提純,所以它成為科學(xué)家最早研究的蛋白質(zhì)之一。今天,當(dāng)需要一種蛋白質(zhì)時(shí),一種來(lái)源于牛體內(nèi)的類(lèi)似的蛋白在研究中被廣泛地使用,這種蛋白就是牛血清蛋白。

研究金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用是生命科學(xué)的重要內(nèi)容,也是化學(xué)和生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。通常人們研究的焦點(diǎn)集中在生命金屬元素在模擬生理?xiàng)l件(pH=7.43)附近或等電點(diǎn)(pH=5.3)附近與血清蛋白的結(jié)合反應(yīng),對(duì)Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Co3+、Mn2+、Cd2+等研究的較多[4-9]。到目前為止的相關(guān)研究所涉及的都是重金屬與血清蛋白鍵的作用和結(jié)合狀態(tài)問(wèn)題[10],而實(shí)際所要解決的是如何將血清蛋白重金屬絡(luò)合物中的重金屬除去。文獻(xiàn)[11]曾對(duì)這方面做過(guò)研究。

本文在不同 pH條件下,研究鉛與牛血清蛋白作為中毒模擬血液的透析性能,并與硝酸鉛溶液的透析性能進(jìn)行對(duì)比,以進(jìn)一步了解鉛與牛血清蛋白的絡(luò)合情況。在生理 pH值條件下,研究了中毒模擬血液在外加電場(chǎng)作用前后的透析性能,以找到有效的除鉛方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:AA240火焰原子吸收光譜儀,雷磁DDSL-308A型電導(dǎo)率儀,BT00-300型蠕動(dòng)泵,BS 124S型電子天平,U型壓差計(jì),鈦基復(fù)合材料電極板,WY-30-1A～3A晶體管穩(wěn)壓電源,F60S空心纖維血液透析濾過(guò)器以及實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的透析裝置(見(jiàn)圖1)和電解槽等。

試劑:濃度為0.05mol/L,pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液;牛血清白蛋白(BSA)(北京博奧星生物技術(shù)有限公司,生化純,用前未進(jìn)行純化);硝酸鉛儲(chǔ)備液含鉛0.24 g/L,冰箱內(nèi)4℃保存;硝酸為分析純;配制原液用水為一次蒸餾水;透析液為一次蒸餾水。為了進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),3種原液的配制見(jiàn)表1。

表1 原液的配制方法

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用圖1所示的試驗(yàn)裝置,將硝酸鉛溶液和含鉛模擬血液(常溫下攪拌 3天)分別放置在原液 1所示位置,通過(guò)蠕動(dòng)泵的抽濾作用,使它們從透析柱的內(nèi)側(cè)由下至上流出,透析液在透析柱的外路通過(guò),流動(dòng)方向由上到下,原液和透析液采取逆流的方式。在一定的壓力和動(dòng)力下(見(jiàn)表2試驗(yàn)參數(shù)),進(jìn)行透析試驗(yàn),在不同的透析時(shí)間下取樣,檢驗(yàn)樣品的電導(dǎo)率和鉛濃度。

圖1 原液不進(jìn)行循環(huán)的透析裝置

表2 試驗(yàn)條件參數(shù)表

將 pH為 7.40的含鉛模擬血液先利用圖1所示試驗(yàn)裝置,進(jìn)行透析,除去其中的小分子物質(zhì),再利用電解實(shí)驗(yàn)裝置,在一定的電流密度下,進(jìn)行電解實(shí)驗(yàn),之后再利用圖1所示試驗(yàn)裝置,進(jìn)行透析試驗(yàn),在不同的時(shí)間下分別取樣,檢驗(yàn)樣品的鉛濃度。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 硝酸鉛溶液和不同pH條件下含鉛模擬血液的透析性能

本試驗(yàn)采用圖1所示的試驗(yàn)裝置,對(duì)3種原液進(jìn)行透析,每隔 5min采樣,利用 AA 240型火焰原子吸收光譜儀和電導(dǎo)率儀對(duì)原液和透析液中的鉛濃度和電導(dǎo)率進(jìn)行檢測(cè)。

圖2 不同條件下的原液和透析液中的鉛濃度變化曲線(xiàn)

(1)原液中鉛濃度變化的比較與分析。根據(jù)圖2a可知:硝酸鉛溶液的鉛濃度在透析很短時(shí)間內(nèi),就達(dá)到很低值,這是由于硝酸鉛溶液中含有大量的鉛離子,鉛離子是小分子,硝酸鉛溶液和透析液逆流通過(guò)透析柱時(shí),透析液帶走了硝酸鉛溶液中的部分鉛離子,使硝酸鉛溶液中的鉛濃度降低。根據(jù)圖2b可知:酸性條件下的含鉛模擬血液,鉛離子和牛血清白蛋白并沒(méi)有發(fā)生絡(luò)合,鉛以小分子形態(tài)存在,在透析作用下,含鉛模擬血液中的鉛濃度降到很低。根據(jù)圖2c可知:中性條件下的含鉛模擬血液,鉛離子與牛血清白蛋白生成了大量的絡(luò)合物,見(jiàn)公式(1)、公式(2),在透析作用下,絡(luò)合物大分子不能通過(guò)中空纖維膜與透析液進(jìn)行交換,故通過(guò)透析之后,鉛濃度維持較高的值。

絡(luò)合物的生成與解離平衡為

絡(luò)合平衡常數(shù)為

在本次試驗(yàn)中,

Kw的數(shù)值較小,一方面表明鉛離子的確與牛血清白蛋白發(fā)生了反應(yīng),另一方面表明發(fā)生的絡(luò)合反應(yīng)不徹底,在本次試驗(yàn)中,導(dǎo)致反應(yīng)不徹底的原因可能是參加反應(yīng)的鉛離子濃度過(guò)低。

關(guān)于鉛與牛血清蛋白的絡(luò)合問(wèn)題,前人曾做過(guò)很多研究。文獻(xiàn)[12]曾借助紫外、紅外和熒光光譜等手段,在生理pH值條件下,測(cè)定了鉛與牛血清蛋白的相互作用,指出肽鏈的C=O基團(tuán)和蛋白質(zhì)上的羥基都可能是Pb2+的作用位置。

(2)原液和透析液中電導(dǎo)率變化的比較與分析。根據(jù)圖3a可知:硝酸鉛溶液中含有大量的自由離子,其電導(dǎo)率的原始值比較高。根據(jù)圖3b可知:在中性含鉛模擬血液中,由于緩沖溶液中存在大量的自由離子,其電導(dǎo)率的原始值比較高。根據(jù)圖3c可知:在酸性含鉛模擬血液中,由于牛血清白蛋白的大量存在,其電導(dǎo)率的原始值比較低。隨著透析的進(jìn)行,原液中的自由離子轉(zhuǎn)移到透析液中,從而原液的電導(dǎo)率降低,透析液的電導(dǎo)率升高,最后雙方達(dá)到平衡。

圖3 不同條件下的原液和透析液中的電導(dǎo)率變化曲線(xiàn)

2.2 基于電化學(xué)的鉛-血清蛋白絡(luò)合物解離試驗(yàn)

采用中性條件下的含鉛模擬血液作為原液,采用試驗(yàn)裝置 1透析 7次,每次分別采樣。然后進(jìn)行電解。再采用試驗(yàn)裝置 1,透析 5次,采樣并測(cè)其鉛濃度。電解過(guò)程中每 2 h采樣,電解 12 h,自電解開(kāi)始到電解結(jié)束,一共采樣 7次,其鉛濃度變化如圖4所示,其多項(xiàng)式擬合曲線(xiàn)的表達(dá)式為y=0.167 6x4-5.078 3x3+55.653x2-271.95x+996.32。

根據(jù)圖4可知:對(duì)中性條件下的含鉛模擬血液進(jìn)行透析后,其中的鉛-血清蛋白絡(luò)合物是大分子,不能透過(guò)中空纖維膜,模擬血液中的鉛濃度達(dá)到穩(wěn)定并保持在 998μg/L(即電解開(kāi)始時(shí)的原始濃度)。電解后取樣并測(cè)定,模擬血液中的鉛濃度達(dá)到 441μg/L。對(duì)電解后的模擬血液進(jìn)行透析,其中的鉛濃度基本保持不變,表明電解后的溶液中存在少部分鉛-血清蛋白絡(luò)合物大分子,而電解過(guò)程中析出的鉛沉積在電極板上。

在電解試驗(yàn)中,原液中存在的主要離子為Cl-、OH-、H+、Pb2+等,為了不對(duì)原液造成污染,電極板選擇鈦基復(fù)合材料。由能斯特方程,可知:

陽(yáng)極的析出電勢(shì)為

其中Cl-優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)。

其中H+優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)。

由槽電壓U=Uc-Ua以及超電勢(shì)的可能值、離子濃度的可能值可知[13]:

外加電壓U=0.059 lg(a(H+))+η3+1.358-0.059 lg(a(Cl-))+η1≈3 V,外加電場(chǎng)在3 V以上,就能發(fā)生電解反應(yīng)。

根據(jù)圖5可知:電解 2 h內(nèi),鉛的析出最為劇烈,此后鉛的析出逐漸減弱,到 4 h時(shí),基本達(dá)到穩(wěn)定值。電解過(guò)程中,模擬血液中鉛濃度的降低更表明了析出的鉛沉積在電極板上。

3 結(jié)論

(1)中性條件下,鉛與牛血清白蛋白發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng),而酸性條件下,鉛與牛血清白蛋白沒(méi)有發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。(2)對(duì)鉛-牛血清白蛋白絡(luò)合物進(jìn)行電解從而降低其中的鉛濃度是可行的,電解出的鉛沉積在電極板上,其去除效果有待于進(jìn)一步的研究。

[1] 郭建春,韓選明.兒童 100例發(fā)鉛與血鉛調(diào)查分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2010,39(1):105-106.

[2] 張巖.鉛中毒防治與血鉛檢測(cè)[M].哈爾濱:黑龍江人民出版社,2003:25-35.

[3] 余瑞元.生物化學(xué)[M].北京:北京出版社,2007.

[4] 梁宏.Cu(Ⅱ),Fe(Ⅱ)與人血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),1999,(57):161-165.

[5] 袁向華.重金屬Hg2+對(duì) NBS修飾前后血清蛋白圓二色譜的影響[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,26, (3):298-301.

[6] GoumakosW,Laussacj P,Sarkar B.Binding of Calium(II)and Zinc(II)to Humin and Dog Serumalbums An Equilibrum Dialysis and 113Cd NMR Study[J].Biochem Cell Biol,2007,69:809-810.

[7] Sadler P J,Viles JH.1H and 113Cd NMR Investigation of Cd2+and Zn2+Binding Sites on Serum Albumin Competion with Ca2+,Ni2+,Cu2+and Zn2+[J].Inorg Chem,1996,35:4490.

[8] 程艷坤.Pb2+、Cd2+與血清白蛋白相互作用的研究[D].石家莊:河北師范大學(xué),2009.

[9] 梁彥秋.銅(Ⅱ)鎘(Ⅱ)、幾種小分子同血清白蛋白的相互作用研究[D].上海:華東師范大學(xué),2007.

[10] 張海蓉.紫外照射下Pb(Ⅱ)與牛血清白蛋白的相互作用研究[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(2):306-311.

[11] 蔡青青,聶偉,梁瑩,等.鉛與牛血清蛋白的相互作用及模擬透析性能[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009, 30(1):75-77.

[12] 高志永,楊林.鉛(Ⅱ)、鎘(Ⅱ)、汞(Ⅱ)與蛋白質(zhì)的作用研究[D].新鄉(xiāng):河南師范大學(xué),2004:15.

[13] 董鐵有,洪妍.三槽隔膜式設(shè)備制取強(qiáng)酸性水的工藝特性[J].食品與機(jī)械,2005,21(2):46-48.