厚樸中厚樸酚及和厚樸酚提取工藝的優化研究

李 銳，陳中蘭，肖 宏，林世和，曾慶源

（1.湖北省鐘祥市人民醫院，湖北 荊門 431900； 2.湖北省武漢市第一醫院，湖北 武漢 430000；3.湖北省武漢市第三醫院，湖北 武漢 430000）

厚蘭荷貼劑為鐘祥市人民醫院經驗方，主要由厚樸[1－2]、板藍根、薄荷等藥材組方，對口腔潰瘍、牙周炎癥等口腔疾病有良好的治療效果。方中主藥厚樸有較強的抗菌作用，其中所含厚樸酚、和厚樸酚是主要的抗菌成分[3－8]。為此，以厚樸酚、和厚樸酚的提取率為考察指標，采用正交試驗設計對厚樸醇提工藝進行優選，為生產工藝參數的確定提供數據支撐。

1 儀器與試藥

中藥材粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；98－1－B型電子調溫電熱套（上海亞榮生化儀器廠）；Starsorius BSI型電子分析天平（d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司）；Dionex－Ulimate 3000型半制備高效液相色譜儀；紫外檢測器。厚樸（批號為080511）購于湖北天濟中藥飲片有限公司，經湖北中醫學院藥學院中藥鑒定教研室陳科力教授鑒定為木蘭科植物厚樸 Magnolia offisenalis Rehd.etWils的干燥干皮；厚樸酚對照品（批號為110729－200310）及和厚樸酚對照品（批號為110730－200609）由中國藥品生物制品檢定所提供；乙醇為化學純，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 厚樸提取物制備

分別精密稱取厚樸飲片9份，每份100 g，按正交設計表安排的因素和水平進行加熱回流提取，提取液過濾，濾液減壓濃縮至相對密度1.10，加2％NaOH溶液調pH約為11，靜置2h，過濾，濾液再加2％的鹽酸溶液調pH約為2，靜置24h，過濾，沉淀水洗至中性，50℃真空干燥，制得厚樸提取物。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Dionex－Acclaim.120 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－水（75∶25）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測波長：294 nm；進樣量：10μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

取厚樸提取物約0.1 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取厚樸酚對照品20.5mg、和厚樸酚對照品12.5mg，精密稱定，加甲醇50mL，分別制成每1mL含厚樸酚410μg、和厚樸酚250μg的混合溶液，即得對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.3 方法學考察

標準曲線制備：分別精密吸取厚樸酚與和厚樸酚對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分別置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述稀釋液10μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程，厚樸酚為 A=6772C+5 361（r=0.999 8），和厚樸酚為 A=11 648×105C－331 291 456（r=0.999 5）。結果表明，厚樸酚與和厚樸酚進樣量分別在0.205～4.1μg和0.125～2.5μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗：分別取厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液各10μL，依法連續進樣測定峰面積。結果厚樸酚與和厚樸酚的 RSD分別為0.79％和0.62％（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，24，48h時測定峰面積。結果厚樸酚、和厚樸酚的 RSD分別為0.91％和1.13％（n=8），表明供試品溶液在48h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為090311）6份，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件進樣測定。結果樣品中厚樸酚、和厚樸酚平均含量分別為5.822mg/g和5.189mg/g，RSD分別為1.60％和1.58％（n=6），表明方法重現性好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為090311）0.25 g共6份，分別精密加入對照品溶液適量，依法測定并計算回收率。結果見表1。

表1 厚樸酚與和厚樸酚加樣回收試驗結果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定峰面積，根據回歸方程求得厚樸酚與和厚樸酚的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=2）

2.3 提取工藝優選

2.3.1 正交設計試驗及結果

在預試驗的基礎上，采用正交試驗優化提取工藝。選取料液比（因素A）、乙醇體積分數（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數（因素D）作為考察因素，各因素取3個水平，以L9（34）正交試驗表安排試驗，以厚樸酚與和厚樸酚得率之和為評價指標，用SPSS12.0統計軟件進行數據處理，對評分結果作直觀分析和方差分析，篩選最佳工藝條件。結果見表3－5。由方差分析結果可知，提取效果的影響因素大小順序為液料比＞提取時間＞提取次數＞乙醇體積分數，液料比、提取時間對結果影響顯著，提取次數、乙醇體積分數則影響不顯著。根據直觀分析，最佳提取條件為A2B2C3D3，但由于因素C和因素D第2水平、3水平結果差異很小，為節約工時并考慮到工業生產實際，決定選取第2水平。因此，優選的提取工藝為A2B2C2D2，即料液比為8，乙醇體積分數為70％，提取3次，每次提取時間為2h。

表3 正交試驗因素水平表

表4 厚樸提取工藝正交試驗結果表

表5 方差分析結果表

2.3.2 驗證試驗

為確定該工藝的優劣和穩定性，據優選的提取工藝，對同一批藥材（取樣量為100 g）進行3次試驗。結果編號為071101，071102，071103的樣品提取物中厚樸酚與和厚樸酚的總得率分別為2.75％，2.68％，2.78％，平均2.74％，RSD=1.88％（n=3）。可見，該提取工藝厚樸酚與和厚樸酚總得率高、重現性好、工藝穩定可行、實際操作簡單，適合工業化生產。

3 討論

厚樸的主要抗菌有效成分為厚樸酚、和厚樸酚，因此正交試驗選取厚樸酚與和厚樸酚總得率為考察指標。關于厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的含量測定方法很多，本研究采用的高效液相色譜法測定正交工藝提取制備的樣品，具有較好的靈敏度和準確度。

厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的提取工藝有冷浸法、煎煮法、超聲法等，但本研究選用的乙醇提取法較以上提取法提取的提取液抑菌效果更佳，且所需設備簡單、工藝穩定、提取效率較高、乙醇低毒、易回收、無污染。

本研究通過正交設計對厚樸酚及和厚樸酚的提取工藝進行優化，優選方法設計簡單可行，符合我院實際應用。另外，優化的提取工藝驗證試驗結果符合預期，說明其有效、合理、穩定可行，適合于工業化大生產。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2005：176.

[2]王承南，夏傳格.厚樸藥理作用及綜合利用研究進展[J].經濟林研究，2003，21（3）：80－81.

[3]鄧世明，程永現，周 俊，等.長緣厚樸中的新苯醌及新木脂素類化合物[J].云南植物研究，2001，23（1）：121－125.

[4]楊 云，張 晶，陳玉婷.天然藥物化學成分提取分離手冊[M].北京：中國中醫藥出版社，2003：540－542.

[5]葉 華，張文清，邱 燕.厚樸花揮發油的GC－MS聯用分析[J].福建中醫藥，2006，37（6）：53－54.

[6]王洪燕，周先禮，黃 帥，等.凹葉厚樸中生物堿成分的研究[J].華西藥學雜志，2007，22（1）：30－33.

[7]林桂蕓，謝生發，謝 鴻，等.和厚樸酚抑菌作用的研究[J].成都大學學報（自然科學版），2003，22（2）：18－20.

[8]Xianhe B，Francesca C，Masuko U，et al.Honokiol，a SmallMolecularWeight Natural Product，Inhibits AngiogenesisinVitro and TumorGrowth in Vivo[J].JBiol Chem，2003，278（37）：35 501－35 507.