以Apo A-I為靶點的基因表達上調劑篩選模型的建立

杜郁，王麗，王麗非，司書毅，楊媛，洪斌

·論著·

以Apo A-I為靶點的基因表達上調劑篩選模型的建立

杜郁，王麗，王麗非，司書毅，楊媛，洪斌

目的建立靶向人 Apo A-I 轉錄調控序列的高通量藥物篩選模型，用于篩選 Apo A-I 基因表達上調劑。

載脂蛋白 A-I； 轉錄啟動子； 熒光素酶類； 藥物評價，臨床前

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2011, 6(3):178-183

高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平降低是心血管疾病的獨立風險因素，它和動脈粥樣硬化疾病的發生存在明確的負相關關系[1]。研究發現，HDL-C 的水平每增加 1 mg/dl，心血管病發生的風險可降低 2％ ～3％[2]。隨著研究的深入，目前傾向認為高密度脂蛋白（HDL）的心血管保護作用很大程度上依賴于它所介導的膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）過程，即 HDL 將膽固醇從周圍組織（包括粥樣斑塊）轉運到肝臟以膽酸形式代謝[3]。因此，提高和改善 HDL 水平與功能，有可能成為動脈粥樣硬化治療的新途徑。

載脂蛋白 A-I（apolipoprotein A-I，Apo A-I）是 HDL 的主要結構蛋白和功能單位，與 HDL 的形成密切相關。Apo A-I 在血漿中的濃度與 HDL-C的水平相關，可通過多種機制發揮抗動脈粥樣硬化作用[4]，有望成為動脈粥樣硬化的治療靶基因之一。通過對肝細胞中 Apo A-I 基因調控區缺失圖譜和轉基因鼠的研究發現，轉錄起點 –220 ～ –110 bp 的啟動子區域存在幾個重要的轉錄因子結合位點，包括 Site A（–214 ～ –192 bp）、Site B（–169 ～ –146 bp）和 Site C（–134 ～ –119 bp），對于維持肝細胞中 Apo A-I 的正常轉錄和表達是必需的[5]。本研究以上述Apo A-I 的啟動子序列為靶點，利用報告基因體系，建立穩定轉染細胞用于基因表達上調劑的高通量篩選。將 Apo A-I 基因上游的 –277 ～ +173 bp 片段克隆于熒光素酶報告基因的上游，得到受 Apo A-I 基因啟動子調控的重組報告基因表達質粒，并獲得了穩定轉染 HepG2 細胞的單克隆細胞株，經篩選條件優化和評價，建立了針對人 Apo A-I 的基因表達上調劑藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質粒、菌株和細胞株 真核細胞表達載體pGL4.17（luc2/Neo）和質粒載體 pGEM-T為美國Promega 公司產品；大腸桿菌 E. coli TG1 為本實驗室保存；人肝癌細胞株 HepG2 為本實驗室保存。

1.1.2工具酶和主要試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等均購自大連寶生物工程公司；PfuDNA 聚合酶購自上海生工生物工程公司；DNA回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；中量質粒提取試劑盒（PureYield? Plasmid Midiprep System）、細胞裂解液和熒光素酶檢測系統（Luciferase Assay System）購自美國 Promega 公司；轉染試劑（Lipofectamine? 2000）購自美國 Invitrogen 公司；MEM 細胞培養基為美國 Thermo 公司產品；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和 G418 抗生素為美國 Gibco 公司產品；二甲基亞砜（DMSO）購自美國 Sigma 公司。

1.1.3儀器 MiniCycle PTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產品；EnVision 多功能微孔板檢測儀為美國 PerkinElmer 公司產品。

1.2 方法

1.2.1DNA 目的片段的體外擴增、克隆及測序 從人肝癌細胞株 HepG2 中抽提獲得基因組DNA，并以此為模板，根據 GenBank 上所收錄的Apo A-I 基因序列（GeneID：335）和文獻[5]報道的人 Apo A-I 基因轉錄調控元件所在位置，通過Primer Premier 5.0 設計 PCR 上游引物 5’ TACTC GAG AGTGCAGGGAACCCCGACC 3’（下劃線表示 Xho I 酶切位點）和下游引物 5’ ATAAGCTT AT GCAGAAGCCCCGTGCTCC 3’（下劃線表示Hind III 酶切位點），擴增位于 –277 ～ +173 bp 區域的人 Apo A-I 基因啟動子序列。PCR 體系反應條件為 94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 變性 50 s，57 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸 60 s（30 個循環）；72 ℃ 延伸 10 min。

將 PCR 擴增產物純化回收，與 pGEM-T 載體連接，轉化至 E. coli TG1 感受態宿主菌，用藍白斑法挑選轉化子。提取純化質粒，酶切鑒定陽性克隆，將含有預期大小片段的重組質粒命名為pGEM-ApoP，測序鑒定插入片段的 DNA 序列。

1.2.2重組質粒的構建和鑒定 Xho I 和 Hind III酶切重組質粒 pGEM-ApoP 和 pGL4.17 質粒，將目的基因片段與雙酶切后的線性 pGL4.17 質粒連接，從而將人 Apo A-I 基因上游啟動子序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報告基因上游，構建完成重組質粒 pGL4-ApoP。重組質粒轉化至 E. coli TG1 中增殖擴增，提取質粒并用 Xho I 和Hind III 進行雙酶切鑒定。

1.2.3細胞培養 HepG2 細胞培養于含 10％ 胎牛血清的 MEM 培養基中，添加 1 mmol/L 丙酮酸鈉和 1％ 非必需氨基酸，37 ℃、5％ CO2條件下培養。0.25％ 胰酶加 0.02％ 乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。

1.2.4重組質粒瞬時轉染與轉染條件優化 轉染用質粒的提取方法按 PureYield? Plasmid Midiprep System 試劑盒說明書進行。轉染前一天，于 30 mm培養皿接種 8 × 105個 HepG2 細胞，待細胞貼壁生長匯聚程度達到 80％ 左右時，按 Lipofectamine?2000 說明書操作，將 pGL4-ApoP 經脂質體介導轉染至 HepG2 細胞。24 h 后，得到瞬時轉染細胞，并測定熒光素酶的表達活性。同時按照 DNA 和轉染劑兩者比例（μg/μl）為 1:1、1:2、1:2.5、1:3 和1:4考察轉染效率。

1.2.5穩定轉染細胞株的構建 將瞬時轉染細胞以 5 × 103個細胞/孔接種于 96 孔板，置于 37 ℃、5％ CO2培養箱內，以含 G418 700 μg/ml 的 MEM選擇培養液篩選穩定轉染細胞株，每 3 ～ 4 天換液一次。兩周后，選擇存活的細胞集落進行擴增培養，測定熒光素酶的表達活性，將活性較高的細胞集落通過有限稀釋法，篩選獲得穩定轉染的單克隆細胞株，經多次傳代培養后熒光素酶的表達活性無明顯降低者可確定為穩定轉染細胞株 ApoP-Luc HepG2。

1.2.6化合物篩選流程及模型評價 將穩定轉染細胞用含 G418 700 μg/ml 的 MEM 選擇培養液調節至 5 × 105個/ml，接種于 96 孔細胞培養板，每孔 100 μl，37 ℃、5％ CO2培養 6 h 后，吸棄培養液上清，更換無血清 MEM 培養液，并加入待篩化合物或 DMSO 對照，孵育 20 h。吸棄細胞培養液上清，PBS 洗滌細胞 2 次，每孔加入 20 μl 細胞裂解液，37 ℃ 孵育 15 min 以充分裂解，加入Luciferase Assay System 中提供的熒光素酶檢測液后，通過 EnVision 微孔板多功能檢測儀讀取熒光素酶活性數值。以熒光素酶的表達活性來考察化合物對 Apo A-I 基因表達的上調作用。熒光素酶活性的評價采用調節率來定義：調節率 =（樣品組細胞熒光素酶活性/DMSO 組細胞熒光素酶活性）× 100％，本研究將化合物樣品的調節率大于 150％定義為初篩陽性。

為評價所構建模型的有效性，將已知陽性化合物染料木素（Genistein）制成不同濃度作用于細胞模型，檢測其對熒光素酶表達活性的影響。同時為評價此篩選模型對高通量篩選的可用性，對信號/背景比（S/B）、信號/噪音比（S/N）和變異系數（CV）進行檢測，按 Zhang 等[6]的方法計算 Z’ 因子，公式如下所示：Z’= 1 －（3 × 陽性對照孔 SD + 3 ×空白對照孔SD）/（陽性對照孔平均值 － 空白對照孔平均值）。

1.2.7化合物篩選條件優化 化合物溶于 DMSO中，作用于穩定轉染細胞的濃度為 10 μg/ml。為優化篩選條件，考察了溶劑 DMSO 濃度以及化合物作用時間對穩定轉染細胞熒光素酶表達活性的影響。

2 結果

2.1 Apo A-I 基因啟動子序列的獲得

以人基因組 DNA 為模板，PCR 擴增得到人Apo A-I 基因啟動子序列，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示獲得預期大小的 DNA 片段（圖 1A）。

將以上 PCR 擴增產物克隆至 pGEM-T 載體中，對重組質粒的插入片段進行序列測定，結果表明所插入片段均與 GenBank 中所登錄的序列（登錄號：NG_012021.1）一致，符合 Apo A-I 基因上游啟動子序列的預期設計。

2.2 報告基因重組質粒的構建

圖1 ApoA-I 基因啟動子序列的 PCR 擴增和 pGL4-ApoP酶切鑒定結果Figure 1 PCR product of human Apo A-I gene promoter and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pGL4-ApoP

對構建的重組質粒 pGL4-ApoP 進行酶切鑒定，結果顯示，Apo A-I 基因上游啟動子序列以正確的方向插入到 pGL4.17 中熒光素酶報告基因的上游（圖 1B）。

2.3 穩定轉染細胞株的建立

擴增得到的 ApoA-I 基因上游啟動子序列含有 –220 ～ –110 bp 區域的幾個重要轉錄因子結合位點，對于在 HepG2 細胞中 Apo A-I 基因的正常表達非常關鍵。熒光素酶表達活性檢測結果顯示，相比未插入啟動子序列的 pGL4.17 質粒，報告基因質粒 pGL4-ApoP 的熒光素酶表達活性明顯增高。同時通過優化重組質粒 DNA 和轉染試劑兩者比例，確定當 DNA: Lipofectamine? 2000 兩者比例為 1:3 時，轉染效率最高（圖2，n = 3）。

圖2 轉染試劑濃度對重組質粒熒光素酶活性表達的影響（空載體 pGL4.17 作為陰性對照）Figure 2 Effects of transfection agent concentrations on luciferase activity after the transiently transfection of recombinant reporter plasmid (promoterless pGL4.17 as a negative control)

2.4 篩選條件的優化

考察了 0.01％ ～ 1％ DMSO 對熒光素酶表達活性的影響，在 0.01％ ～ 0.1％ 的濃度范圍內，DMSO 不會對 ApoP-Luc HepG2 穩定轉染細胞株的熒光素酶活性表達產生明顯影響（圖 3A，n = 3）。故篩選時采用 DMSO 溶劑的終濃度為 0.1％。為確定化合物作用的合適時間，參閱文獻[7]的報道，選擇 16、18、20 和 24 h 檢測細胞熒光素酶表達活性。結果表明，從 16 ～ 20 h，ApoP-Luc HepG2 穩定轉染細胞株的熒光素酶活性存在緩慢上升趨勢，20 h 后，表達趨于穩定。因此，確定化合物作用于穩定轉染細胞的時間為 20 h（圖 3B，n = 3）。

2.5 模型驗證與評價

不同濃度的 Genistein 作用細胞模型20 h后，測定熒光素酶表達活性。結果顯示，對于 ApoP-LucHepG2 穩定轉染細胞，在一定濃度范圍內，熒光素酶相對活性值隨著 Genistein 濃度的增加而升高，呈濃度依賴性，EC50為 3.57 μmol/L（圖4，n = 3）。本研究中 Genistein 對 Apo A-I 轉錄激活作用與文獻[8]報道一致，說明 Genistein 能有效作用于已構建的 pGL4-ApoP 表達載體，其對 Apo A-I 基因的轉錄激活作用能通過熒光素酶活性得到反映，從而證明所構建的穩定轉染細胞用于此類藥物篩選的可行性。選取 Genistein 作為模型的陽性對照，對模型的可靠程度、敏感度、重現性和準確性加以衡量，評價了多項高通量篩選指標。結果表明，S/B、S/N、CV 和Z’因子分別為 5.12、30.1、6.1 和0.68，優于進行高通量篩選試驗所要求的 ＞ 3、＞ 10、＜ 10 和 ≥ 0.5的標準。說明本研究建立的模型穩定可靠，適合應用于高通量篩選。

圖3 模型篩選條件的優化結果Figure 3 Results of optimization on screening model

2.6 化合物初步篩選結果

應用該模型對本研究所的化合物庫進行了篩選，通過檢測熒光素酶活性，發現白藜蘆醇和毛蕊異黃酮、芹菜素、高良姜素和千層紙素 A 等黃酮類化合物對 Apo A-I 轉錄活性上調作用明顯，進一步采用不同濃度的上述化合物作用于 ApoP-Luc HepG2 穩定轉染細胞，證明上述化合物的轉錄激活作用均呈現劑量依賴性，半數有效濃度分別為0.49、9.40、4.81、8.49 和 7.45 μg/ml（圖5）。

圖4 染料木素對穩定轉染細胞模型的量效曲線Figure 4 Effects of Genistein on lucifearase activity in stable transfected cell model

圖5 活性化合物對 ApoP-Luc HepG2 細胞熒光素酶活性影響（每濃度設 4 個復孔，結果以平均值表示）Figure 5 Effects of active compounds on luciferase activity in ApoP-Luc HepG2 cells (Each sample was quadruplicated and quantitative data are expressed as mean)

3 討論

心血管疾病是全球范圍造成死亡的首要原因，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）以富含脂肪的斑塊在大動脈壁聚積為主要特征，是心血管病的主要病理基礎。20 世紀 80 年代以來，以他汀類為代表的藥物（HMG-CoA 還原酶抑制劑）在治療動脈粥樣硬化領域取得了重大進展，主要通過減少低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平來干預血脂水平、減少心血管事件發生。盡管他汀類藥物能減少約 30％ 的冠狀動脈事件[9]，但每年仍有9％ 的受治患者受到殘余心血管病變風險的困擾[10]。因此，進一步降低動脈粥樣硬化心血管疾病發生，有必要關注除 LDL-C 以外的相關血脂風險因素。

人 Apo A-I 蛋白主要在肝臟和小腸中表達，成熟的 Apo A-I 蛋白含有 243 個氨基酸。Apo A-I 是 HDL 顆粒中最主要的載脂蛋白，約占 HDL 中蛋白總含量的 70％，在 HDL 的形成、代謝和功能方面都具有重要作用。人 Apo A-I 基因缺失會導致血漿 HDL 水平低下和家族性低 α-脂蛋白血癥，容易造成早發性動脈粥樣硬化[11-12]。采用轉基因動物和體細胞基因轉移的手段證明過表達 Apo A-I 基因可以增加 HDL-C 水平，減緩動脈粥樣硬化進程，并在一定程度上使斑塊退化[13-14]。Apo A-Imilano是 Apo A-I 的天然突變體，其 173 位的精氨酸被半胱氨酸所取代，該基因突變的攜帶者罹患心血管疾病的風險很低，臨床試驗證明輸注 Apo A-Imilano突變體和磷脂復合物，有助于動脈粥樣斑塊的消退，推測與增強泡沫化巨噬細胞膽固醇外排有關[15]。這些研究提示 Apo A-I 有可能是心血管疾病調脂治療的一個重要靶點。

Apo A-I 的基因表達調控主要發生在轉錄水平，靠近 Apo A-I 基因轉錄起點的位置存在類似TATA 盒的結構；其 5’ 上游序列 –220 ～ –110 bp區含有若干轉錄因子結合位點，受到包括視黃醇類物質 X 受體（RXR），過氧化物酶體增殖物激活型受體 α（PPARα）和肝 X 受體（LXR）在內的核受體的調控；5’ 側翼的高 GC 區域存在胰島素應答核心元件（insulin response core element，IRCE），可同轉錄因子 Sp1 結合。這些轉錄因子單獨或者相互協同作用，通過影響 Apo A-I 的基因表達來應答激素、代謝、飲食及藥物的變化和刺激。本研究采用的人 Apo A-I 基因啟動子序列，包括了轉錄起始位點和若干重要的轉錄因子結合位點，有望在分子機制方面進行深入的研究。

構建穩定轉染細胞采用的是 HepG2 細胞，它保留了人類正常肝實質細胞的許多功能，含有與Apo A-I 基因表達相關的必要轉錄因子，能夠比較真實地反映 Apo A-I 在肝臟中表達的環境，更有利于我們篩選得到作用明確的 Apo A-I 基因表達上調劑。

G418 抗性篩選和熒光素酶表達活性的檢測結果顯示，穩定轉染的 HepG2 細胞中含有受 Apo A-I 上游啟動子區調控的熒光素酶重組表達質粒，并能夠穩定地隨細胞培養傳代，說明成功得到穩定轉染有 Apo A-I 啟動子序列的細胞株。我們選擇文獻報道的 Genistein 檢測其對 Apo A-I 轉錄活性的影響，結果表明，Genistein 能提高穩定轉染細胞中 Apo A-I 的轉錄活性。后續的篩選發現，除Genistein 之外，多個黃酮類化合物都能以劑量依賴的方式作用于 Apo A-I 調控區，可能與這些化合物具有植物雌激素作用，能結合雌激素受體相關。另外，白藜蘆醇在本篩選模型上顯示出較好的活性，根據文獻報道，這類均二苯乙烯類衍生物能夠上調Apo A-I的表達水平[16]。目前，研究人員發現一種名為 RVX-208 的白藜蘆醇結構衍生物，能夠在轉錄水平提高 Apo A-I 基因表達，已進入了臨床 II期實驗[17]，正在進行藥代動力學和安全性相關評價，有望治療因 HDL-C 水平低下而引起的心血管疾病。

本研究利用報告基因的檢測方法建立了適用于高通量篩選的人 Apo A-I 基因表達上調劑篩選模型，可以在細胞水平大規模篩選作用于 Apo A-I基因表達調控序列的小分子化合物。有關陽性化合物對 Apo A-I 基因表達的影響目前正在進一步研究中，有可能獲得治療動脈粥樣硬化心血管疾病的新型先導化合物。

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MethodsHuman genomic DNA was used as a template to amplify the promoter sequence of Apo A-I using PCR. The fragment was cloned into pGEM-T vector and characterized by sequencing. The promoter fragment was then inserted upstream of luciferase reporter gene of pGL4.17, and then transfected into HepG2 cell line using LipofectamineTM2000. Stable transfectant was obtained using limited cell dilution method in the presence of G418. Samples were detected by measuring luciferase activity of stable transfected HepG2 cells in 96-well format after assay optimization and validation with genistein.

ResultsThe promoter sequence of Apo A-I containing essential transcriptional elements was obtained from human genomic DNA by PCR. The reporter plasmid named pGL4-ApoP was constructed by inserting the promoter sequence upstream of luciferase reporter gene of pGL4.17. The drug screening model was established and evaluated using genistein as a positive control. Z’-factor is above 0.5, showing that this model was robust and reliable. About 5000 compounds were screened and resveratrol and several flavonoids were identified as positive compounds.

ConclusionThis new drug screening model could be efficiently applied to screen up-regulators of human Apo A-I gene expression.【Key Words】Apolipoprotein A-I; Transcription initiation site; Luciferases; Drug evaluation, preclinical

Author Affiliations:Department of Bioengineering (DU Yu, WANG Li, WANG Li-fei, YANG Yuan, HONG Bin), National Laboratory for Screening New Microbial Drugs (SI Shu-yi), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

Establishment of a high-throughput screening model for identifying up-regulator of human Apo A-I expression

DU Yu, WANG Li, WANG Li-fei, SI Shu-yi, YANG Yuan, HONG Bin

ObjectiveTo establish a high-throughput screening model based on transcriptional regulation of human apolipoprotein A-I for identifying up-regulator of Apo A-I gene expression.

s:HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com; YANG Yuan, Email: yangyuan78@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.03.003

國家自然科學基金（30801401）；“重大新藥創制”科技重大專項“十一五”計劃（2009ZX09302-004）

100050 北京，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所衛生部抗生素生物工程重點實驗室（杜郁、王麗、王麗非、楊媛、洪斌），國家新藥（微生物）篩選實驗室（司書毅）

洪斌，Email：binhong69@hotmail.com；楊媛，Email：yangyuan78@hotmail.com

2011-03-16

方法以人基因組 DNA 為模板，PCR 擴增 Apo A-I 上游的啟動子序列，克隆至熒光素酶報告基因質粒 pGL4.17 上游，采用脂質體介導的方法將重組質粒轉染人肝癌細胞HepG2，在 G418 抗性存在的條件下，通過有限稀釋法篩選穩定轉染細胞株。對溶劑濃度和藥物作用時間進行條件優化，應用陽性化合物染料木素評價模型有效性，通過檢測熒光素酶的表達活性變化來篩選人 Apo A-I 基因表達上調劑。

結果通過 PCR 成功擴增了人 Apo A-I 基因上游的啟動子序列，構建了相應的重組熒光素酶報告基因質粒 pGL4-ApoP，并建立穩定轉染細胞株 ApoP-Luc HepG2。對篩選條件優化后，應用陽性化合物進行評價，篩選窗相關系數 Z’因子為 0.68，大于 0.5，適于進行高通量篩選。應用該篩選模型對 5000 余種化合物進行篩選，4 個黃酮類化合物和白藜蘆醇顯示出較好的活性，半數有效濃度均小于 10 μg/ml。

結論成功建立了人 Apo A-I 基因表達上調劑篩選模型，并利用該模型篩選到 5 個活性化合物。

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183