骨肉瘤中 Bcl-2和 ILK表達(dá)的生物學(xué)意義研究

遼寧省人民醫(yī)院(110016) 杜振廣 肖明明

中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 94期 鄧 寧

惡性腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特性是其對(duì)周?chē)M織的侵襲和破壞,并在遠(yuǎn)隔器官形成轉(zhuǎn)移灶,這是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,與腫瘤細(xì)胞表面黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白水解酶類(lèi)和腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)關(guān)系密切。骨肉瘤是好發(fā)于青少年的高度惡性腫瘤,其侵襲性強(qiáng),較早出現(xiàn)肺等器官的轉(zhuǎn)移,且手術(shù)切除后較易復(fù)發(fā),因此對(duì)骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的相關(guān)因素進(jìn)行研究具有重要的理論及臨床意義。本研究采用免疫組織化學(xué) S-P法探討了 Bcl-2和整合素連接激酶(ILK)骨肉瘤、正常骨中表達(dá)的生物學(xué)意義,為骨肉瘤的預(yù)后判定和基因治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 正常對(duì)照組 15例,骨肉瘤標(biāo)本 30例。骨肉瘤取自 2002～2009年遼寧省范圍內(nèi) 4家醫(yī)院截肢、腫瘤切除或手術(shù)切取活體檢查的標(biāo)本,用液氮保存。術(shù)后所有標(biāo)本經(jīng) 3位病理學(xué)專(zhuān)家確定診斷。全部病例術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移,均未做化療,術(shù)后或確診后行相同化療方案。根據(jù)劉昌茂分級(jí)法：將其分為Ⅰ級(jí) 15例,Ⅱ級(jí) 10例,Ⅲ級(jí) 5例。隨訪(fǎng)結(jié)果：死亡 17例,存活 13例。分成生存組和死亡組。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體 Bcl-2;鼠抗人單克隆抗體 ILK;兩者及免疫組化 S-P試劑盒均為Zymed公司產(chǎn)品。

1.3 方法 標(biāo)本均經(jīng) 10%中性甲醛緩沖液固定。不含鈣固定 6～8小時(shí),含鈣固定 24～48小時(shí)。固定后,含鈣經(jīng) 10%EDTA中性溶液脫鈣 3～5周。然后,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。按S-P免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒所附操作程序進(jìn)行。所有切片染色按相同條件進(jìn)行染色。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 ILK染色結(jié)果判定 以胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性,至少觀察 5個(gè)具代表性的高倍視野(10×40)計(jì)數(shù)500個(gè)瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),按陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例分為 5級(jí)：陰性;＜25%為Ⅰ級(jí),25%～50%為Ⅱ級(jí),＞50%～75%為Ⅲ級(jí),＞75%為Ⅳ級(jí)。

1.4.2 Bcl-2染色結(jié)果判定 參照王東等的判斷標(biāo)準(zhǔn)稍加改進(jìn)。陽(yáng)性反應(yīng)為黃到棕黃色顆粒。定位于胞漿,亦可見(jiàn)于胞膜。計(jì)數(shù) 10個(gè)高倍視野(10×40),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜5%為陰性,5%～25%為 1分,＞25%～50%為 2分,＞50%～75%為 3分,75%以上為 4分。按陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度,淡黃色計(jì) 1分,黃色計(jì) 2分,棕黃色計(jì) 3分;兩者相乘,1～4分為弱陽(yáng)性(+),5～8分為中等陽(yáng)性(?),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(?)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Bcl-2陽(yáng)性率的差異比較用四格表確切概率法。Bcl-2和 ILK指標(biāo)染色強(qiáng)度比較用成組設(shè)計(jì)兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon法),Bcl-2和 ILK相關(guān)性采用 X2檢驗(yàn),取 P＜0.05作為差異有顯著性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-2、ILK染色 Bcl-2為細(xì)胞漿著色,呈棕黃色均勻顆粒狀。部分細(xì)胞有胞膜著色。ILK陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色。

2.2 Bcl-2表達(dá)情況 骨肉瘤組與正常骨組染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度相比,差異均有顯著性(P＜0.05)。骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級(jí)組與Ⅰ級(jí)組,死亡組與生存組染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度相比,雖有下降趨勢(shì),但差異均無(wú)顯著性(P＞0.05),見(jiàn)表 1。

表1 Bcl-2表達(dá)情況

2.3 ILK表達(dá)情況 骨肉瘤組與正常骨組,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級(jí)組與Ⅰ級(jí)組,死亡組與生存組相比,ILK差異有顯著性(P＜0.05),見(jiàn)表 2。

表2 ILK表達(dá)情況(例)

2.4 Bcl-2和 ILK的相互關(guān)系 通過(guò) 2×2列聯(lián)表進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) Bcl-2和 ILK表達(dá)一致性占 76.7%,兩者表達(dá)具顯著相關(guān)性(P＜0.05),見(jiàn)表 3。

表3 Bcl-2與 ILK的關(guān)系

3 討 論

Bcl-2為拮抗細(xì)胞凋亡的基因,其產(chǎn)物并不加速細(xì)胞分裂、增殖而是促進(jìn)細(xì)胞生存,作為“生存基因”保持正常或癌變細(xì)胞免受各種誘導(dǎo)劑誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。有學(xué)者證實(shí),Bcl-2能抑制骨肉瘤細(xì)胞系的凋亡[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組比正常骨組 Bcl-2蛋白染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度均增高,提示骨肉瘤發(fā)生與拮抗凋亡基因 Bcl-2表達(dá)增高有關(guān)。Bcl-2基因表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系目前頗有爭(zhēng)議[3]。Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡,理論上該基因表達(dá)越高,腫瘤惡性程度應(yīng)越高,預(yù)后應(yīng)越差。某些腫瘤如胃癌、結(jié)腸異時(shí)性腺瘤等與此相符。某些腫瘤如胰腺癌等研究結(jié)果卻與之相反。某些腫瘤如滑膜肉瘤等發(fā)現(xiàn) Bcl-2蛋白表達(dá)和預(yù)后無(wú)關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著骨肉瘤分級(jí)的增加,隨著生存時(shí)間的減少,Bcl-2蛋白染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度均有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示 Bcl-2蛋白染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度不能作為判斷骨肉瘤分級(jí)和預(yù)后的指標(biāo)。由于本研究樣本數(shù)量較小,骨肉瘤中Bcl-2蛋白表達(dá)的生物學(xué)意義尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

ILK是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有 3個(gè)結(jié)構(gòu)單位的Ser/Thr蛋白激酶,作為整合素和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要效應(yīng)物,ILK調(diào)節(jié)著細(xì)胞的粘著、生存、分化和凋亡[2]。其相關(guān)蛋白 PKB、GSK3等是細(xì)胞程序死亡和細(xì)胞周期循環(huán)的重要調(diào)節(jié)蛋白[4-6]。由于這些原因,使得 ILK與腫瘤的形成、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等密切相關(guān)。ILK在許多腫瘤中都存在過(guò)量表達(dá),ILK的過(guò)量表達(dá)或組成性活化與腫瘤的形成和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ILK在骨肉瘤組與正常骨組,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級(jí)組與Ⅰ級(jí)組,死亡組與生存組相比,ILK差異有顯著性,提示 ILK在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的的合成與降解代謝而影響細(xì)胞之間,細(xì)胞與基質(zhì)之間的信息傳遞,調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及遷移,進(jìn)而可能影響腫瘤的生物學(xué)行為。

[1] Lin D,Feng J,Chen W.Bc l-2 and caspase-8 related anoikis resistance in human osteosarcoma MG-63 cells[J].Cell Biol Int,2008,32(10)：1199

[2] Kaseta MK,Khaldi L,Gomatos IP,et al.Prognostic value of bax,bc l-2,and p53 staining in primary osteosarcoma[J].J Surg Oncol.2008,1;97(3)：259

[3] Córdoba A,Guerrero D,Larrinaga B,et al.Bcl-2 and CD 10 expression in the differential diagnosis of trichoblastoma,basal cell carcinoma,and basal cell carcinoma with follicular differentiation[J].Int JDermatol,2009,48(7)：713

[4] Lal H,Verma SK,Foster DM,et al.Integrins and proximal signaling mechanisms in cardiovascular disease[J].Front Biosci.2009,1;14：2307

[5] Honda S,Shirotani-Ikejima H,Tadokoro S,et al.Integrin-linked kinase associated with integrin activation[J].Blood,2009,21;113(21)：5304

[6] Kim YB,Choi S,Choi MC,etal.Cell adhesion-dependent cofilin serine 3 phosphorylation by the integrin-linked kinase.c-Src complex[J].JBiol Chem,2008,11;283(15)：10089

[7] Kim YB,Lee SY,Ye SK,et al.Epigenetic regulation of integrinlinked kinase expression depending on adhesion of gastric carcinoma cells[J].Am JPhysiol Cell Physiol.2007,292(2)：857

[8] Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition and integrin-linked kinasemediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells[J].Cancer Res.2008,1;68(7)：2391

[9] RosanòL,Spinella F,Di Castro V,et al.Integrin-linked kinase functions as a downstream mediator of endothelin-1 to promote invasive behavior in ovarian carcinoma[J].Mol Cancer Ther,2006,5(4)：833

[10] Edwards LA,Woo J,Huxham LA,et al.Suppression of VEGF secretion and changes in glioblastomamultiformemicroenvironment by inhibition of integrin-linked kinase(ILK)[J].Mol Cancer T-her,2008,7(1)：59

[11] Wong RP,Ng P,Dedhar S,et al.The role of integrin-linked kinase in melanoma cellmigration,invasion,and tumor growth[J].Mol Cancer Ther.2007,6(6)：1692

[12] Okamura M,Yamaji S,Nagashima Y,et al.Prognostic value of integrin beta1-ILK-pAkt signaling pathway in non-small cell lung cancer[J].Hum Pathol,2007,38(7)：1081