穿心蓮對血管成形術后家兔血小板促血管平滑肌細胞增殖的影響

何浩，汪道文

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院心血管內科，合肥230001;2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心內科)

經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后再狹窄一直是其主要的并發癥而影響其遠期療效。盡管藥物洗脫支架(DES)明顯改善了其近期療效，但由于冠脈狹窄的原因及機制較為復雜，因而有關PCI的很多問題仍懸而未決。其多數學者認為［1］，PCI直接導致血管組織損傷，血小板粘附和激活，促進血管平滑肌細胞遷移和增生而導致管腔狹窄，這是其最主要機制，血小板和血管平滑肌細胞(VSMCs)在再狹窄發生和發展過程中起關鍵性作用。本文著重探討中藥穿心蓮對血管成形術后血小板促血管平滑肌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 動脈粥樣硬化(AS)動物模型和腔內血管成形術(TA) 選正常3～4周齡日本大耳白兔10只(由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院動物實驗中心提供)，每日每只兔給飼含膽固醇0.5g、豬油1.0 g的標準混合飼料。1周后打開家兔腹腔，暴露其腹主動脈，用無齒鑷輕夾動脈3次，通過擠壓和摩擦作用損傷動脈內膜，長度3 cm。術后關閉腹腔，繼續給高脂飼料。4周后以76%泛影葡胺進行血管造影。血管造影見狹窄后，對狹窄段血管進行TA術，共6只。選直徑3.0 mm的Gruentzig球囊導管，在導絲引導下以4個標準大氣壓進行充液擴張，連續3次，每次持續30 s，直至狹窄段被充分擴開。

1.2 VSMC培養 分別取正常段、AS狹窄段及TA后40 h的擴張段腹主動脈中膜組織進行VSMCs培養，原代細胞培養采用組織貼塊法，培養液為含100 ml/L胎牛血清(美國 Gibco Lab)的 Eagle培養基(日本制藥株式會社)，用5%碳酸氫鈉將培養液PH值調至7.0。置于含5%CO2、37℃細胞培養箱中下靜置培養。培養1～2周后細胞長滿瓶壁，用0.1%胰蛋白酶化融合的細胞，進行常規傳代培養。選其3～4代生良好的細胞進行分組實驗。

1.3 細胞計數 用0.1%胰蛋白酶消化上述各組細胞，將細胞懸液濃度制成3×108/L后，在24孔培養板中培養24 h后進行分組實驗。正常、AS狹窄段及TA后3組VSMCs各分成3個亞組，分別向3個亞組培養孔中加人:(1)穿心蓮(為二次提取物，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院贈，終濃度100 mg/L);(2)血小板(2.0×108/L ，以二磷酸腺苷(ADP)誘聚激活，誘聚濃度3μmol/L);(3)穿心蓮+血小板(終濃度同前，旨在用穿心蓮對血小板進行預處理;(4)ADP(終濃度3μmol/L);(5)細胞培養液(對照組)，以觀察不同刺激物對VSMCs生長的影響。另對擴張前的AS段細胞培養孔中加入等量培養液，與TA－VSMCs對照組進行比較，觀察兩者生長速度的快慢。每個亞組在培養板上設4～6孔，每孔總體積1.3 ml，再培養36 h后終止試驗，重復試驗3次。最后在光鏡下直接進行細胞計數。

1.4 125碘一尿嘧啶脫氧核苷(125I—UdR)參入另將各組細胞濃度制成3×108/L，24孔細胞培養板中每孔加入細胞懸液1 ml，培養24 h后開始分組實驗，具體分組方法同細胞計數實驗分組。加入刺激物和培養液后再加入標記物125I－UdR，每孔1微居里(μCi)，繼續培養16 h后終止實驗，重復實驗3次。以微孔濾膜(孔徑0.45μm)分離VSMCs，將濾膜置于試管中，以γ閃爍計數器(FJ 2017)測定每管的放射性強度，以每分鐘的放射計數率(cpm)大小來反映VSMCs內DNA的合成量多少。

2 結果

2.1 AS狹窄段和TA后40 h的VSMCs增殖的變化 TA后40 h的VSMCs組細胞計數和放射計數率均較術前AS狹窄段VSMCs組有所增加，但差異無統計學意義，見表1。

表1 AS狹窄段及TA后VSMCs的細胞計數及放射計數率

2.2 激話的血小板對TA前后VSMCs增殖的直接作用 如表l所示，AS狹窄段VSMCs組在加入血小板懸液培養后，與同種細胞對照組相比，其細胞計數及放射計數率均明顯增加，差異有統計學意義。而加人血小板誘聚劑ADP培養的VSMCs組與為穿心蓮處理的VSMCs組比較，其細胞計數和放射計數率均明顯降低，差異有統計學意義。

3 討論

Clowes等［2］早期就有發現，用球囊剝脫動脈內皮后，VSMCs增殖在2～3 d達到高峰。本研究結果顯示，TA后40 h較TA前AS狹窄段的VSMCs的細胞計數及放射計數率雖有所增加(約22%左右)，但無顯著性差別，這正說明TA后40 h的VSMCs繁殖可能有加快趨勢但此時的VSMCs尚未達到增殖高峰。這可能是部分VSMCs已開始增殖，而另一部分則處于增殖前或靜止期狀態。

Friedman等［3］對血小板減少的家兔內皮進行球囊剝脫損傷，結果這些家兔的動脈損傷段的內膜增厚明顯不如血小板計數正常的對照組家兔。這一研究間接證明了血小板對內膜增生的促進作用。本研究結果表明，激活的血小板對TA前后的VSMCs增殖具直接的作用。加入血小板的VSMCs組較自身對照紐的細胞計數和放射計數率均明顯增加。而血小板誘聚劑ADP對VSMCs增殖則沒有影響。這說明血小板對VSMCs的作用歸因于血小板釋放的其他活性物質，如生長因子。無齒鑷鉗夾擠傷和TA術球囊撕裂損傷內膜，使內皮下膠原纖維和彈力纖維暴露，血小板在局部粘附聚集并釋放出包括血小板源生長因子(PDGF)等在內的一些活性物質，刺激VSMCs增生。VSMCs增殖是一種組織損傷后的修復反應［1］，但過度增生則使內膜增厚而形成管腔的再狹窄。

有報道，發現穿心蓮(APN)提取物能明顯抑制ADP和腎上腺素誘導的血小板聚集反應［4］，并可抑制血管平滑肌細胞的增生［5］。API預防用藥能夠顯著減少主動脈脂質斑塊面積［6］，從而減少動脈粥樣硬化性狹窄的發生率［7］。本實驗結果提示，加入穿心蓮對血小板進行預處理后，改組細胞計數和放射計數率均較未加血小板處理的血小板組明顯減少，說明穿心蓮能抑制血小板活性物質所致的VSMCs的增生，提示穿心蓮對PCI后血小板促VSMCs增生等組織修復反應導致的血管再狹窄可能是值得進一步研究的藥物。關于其機制，尚不十分清楚，可能是與穿心蓮使血小板內使前列環素(PGI2)、環磷酸腺苷(cAMP)含量增多，纖溶酶原激活物抑制物(PAI)活性降低有關［5］，升高的cAMP可以抑制血小板的活性［8］。

［1］ 高志國，黃鶴，陳宏才，等.經皮冠狀動脈腔內成形術后再狹窄機制的研究進展［J］.實用醫學進修雜志，2000，28(108):76-79.

［2］ Clowes AW.Significance of quiwscent smoothmusclemigration in the njured rat carotid arterty［J］.Circulation research，1985，56(2):139-145.

［3］ Friedman RI.The effect of thrombocytopenia on experimented arteriosclerotic lesion formation in rabbit［J］.J Clin Invest，1977，60(5):1190-1210.

［4］ 方淑賢，鄭恒，劉東，等.穿心蓮內酯對二磷酸腺苷誘導血小板聚集的拮抗作用［J］.醫藥導報，2004，23(11):806-808.

［5］ 吳露，鄧常青.中藥防治經皮冠狀動脈成形術后血管再狹窄研究進展及思考［J］.中國中醫藥信息雜志，2008，15(2):79-81.

［6］ 張杰，徐列明.中藥對血小板源生長因子的調控作用研究進展［J］.中西醫結合學報，2004，2(3):99-101.

［7］ 汪道文，趙華月，湯執云.穿心蓮提取物預防粥樣硬化性動脈狹窄的實驗研究［J］.中國循環雜志，1994，9(5):295-298.

［8］ Gorman RR.Medulation of human platelet adenlate by prostacyclin［J］.Prostaglandins，1977，13(3):377-382.