分子標記技術在棉花育種中的應用

趙興華，渠云芳，黃晉玲

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

與其他農作物相比，棉花的基因組學及利用分子標記技術進行棉花育種改良等方面的研究比較落后。近30 a來，隨著分子生物學和生物信息學的迅速發展，使得建立在DNA水平上的、以揭示棉花遺傳的分子標記技術研究成為可能。

分子標記是以DNA分子堿基序列的變異為基礎，所揭示的多態性直接反映基因組DNA間的差異。與形態學標記、細胞學標記和生化標記相比，分子標記具有準確度高、數量多、多態性高、共顯性好、對表型無影響、檢測手段簡單快捷以及開發和使用成本低等優越性。因此，分子標記技術以其自身的優越性在棉花遺傳圖譜構建、分子標記輔助選擇育種、重要農藝性狀基因的標記定位、種質資源的遺傳多樣性分析和純度鑒定等方面具有重要的應用價值[1]。

本文對棉花上應用的幾種分子標記技術以及它們在棉花育種中的應用與展望進行了闡述。

1 分子標記的類型

分子標記根據其產生的特點，大致可分為4類[2]：第一類，以DNA—DNA雜交技術為基礎，如限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP），數目可變串聯重復序列多態性（Variable Numberof Tandem Repeat，VNTR）。第二類，以PCR技術為基礎，如隨機擴增片段長度多態性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），序列特異性擴增片段（Sequence-Characterized Amplified Region，SCAR），相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP），靶位區域擴增多態性（target region amplified polymorphism，TRAP），擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。第三類，以DNA單鏈、單核苷酸多態性為基礎，如單鏈物質多態性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），衍生的酶切擴增多態性（derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS）。第四類，原位雜交技術（In Situ Hybridization，ISH），包括熒光原位雜交（Fluorecence In Situ Hybridization，FISH）和基因組原位雜交（Genome In Situ Hybridization，GISH）等。

2 幾種分子標記的原理及特點

2.1 簡單重復序列（SSR）

簡單重復序列也稱微衛星DNA，其串聯重復的核心序列為1～6 bp。其中，在農作物中最常見的二核苷酸重復單位是（AC）n和（GA）n，每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目10～60個，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。SSR標記的基本原理：根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳分析核心序列的長度多態性。

與其他分子標記相比，SSR標記具有的優點[3-4]為：（1）所需 DNA 量少；（2）覆蓋整個基因組，多態性高；（3）具有多等位基因的特性；（4）呈共顯性遺傳。缺點是：在采用SSR技術分析微衛星DNA多態性時，必須知道重復序列兩端的DNA序列的信息，如不能直接從DNA數據庫查尋獲得，則首先必須對其進行測序。

2.2 相關序列擴增多態性（SRAP）和靶位區域擴增多態性（TRAP）

相關序列擴增多態性和靶位區域擴增多態性是基于PCR標記最近發展起來的新型分子標記系統。其中，SRAP由Li等[5]于2001年提出，又叫基于序列擴增多態性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）[6]。該標記通過獨特的雙引物設計，對基因的 ORFs（Open reading frames）的特定區域進行擴增，上游引物對外顯子區域進行特異擴增，下游引物對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增，因不同個體以及物種的內含子、啟動子與間隔區長度不同而產生多態性。

TRAP由Hu等[7]于2003年提出，其技術是從SRAP技術改進而來的。SRAP使用2個任意引物；而TRAP是使用長度為16～20 bp核苷的固定引物與任意引物，固定引物以公用數據庫中的靶EST序列設計而來，任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、可與內含子或外顯子區域配對的隨機序列[8]。SRAP和TRAP分子標記都可檢測基因的可譯框（ORFs）區域，但引物設計是SRAP與TRAP分析的關鍵，SRAP標記技術無須任何序列信息，而TRAP技術需要基于已知cDNA或EST序列信息設計固定引物才可進行PCR擴增。

2.3 擴增片段長度多態性（AFLP）

擴增片段長度多態性是1993年荷蘭科學家Zebeau Mare等[9-10]發展起來的一種新的分子標記技術。AFLP是RFLP與PCR相結合的產物，其基本原理是：先利用限制性內切酶水解基因組DNA產生不同大小的DNA片段；再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接，作為擴增反應的模板DNA；然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增；最后在接頭互補鏈的基礎上添加1～3個選擇性核苷酸作引物，對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測多態性。

AFLP結合了RFLP和RAPD這2種技術的優點，分辨率高、穩定性好、效率高。但它的技術費用昂貴，對DNA的純度和內切酶的質量要求較高，并且AFLP分析需要同位素或非同位素標記引物，在具有放射性同位素操作過程中，必須具備特殊的防護措施以及配套的儀器設備。

2.4 單核苷酸多態性（SNP）

單核苷酸多態性是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等，是近年來提出的第3代DNA分子標記。SNP的最佳檢測方法是DNA芯片技術，隨著DNA芯片技術的發展，其有望成為最重要、最有效的分子標記技術。

3 分子標記技術在棉花育種中的應用

3.1 群體結構、親緣關系分析及分類學研究

棉花在長期的自然選擇和人工選擇過程中，形成了不同的種群和品系，基因頻率也發生了不同程度的分化，有時根據表型差異很難區分它們之間的親緣關系。而DNA分子標記技術可作為測定基因頻率變化的有效手段，主要通過DNA的擴增條帶計算遺傳相似程度，進而研究棉花的種群親緣關系。聶以春等[11]選用80個隨機引物，對栽培種陸地棉、野生種雷蒙德氏棉以及它們的雜種1代和回交后代中選育得到的9個種質系進行了RAPD遺傳相似性研究，認為29個隨機引物擴增的條帶具多態性，并能將2個不同棉種、F1和種質系相互間加以區別。朱美霞等[12]應用RAPD-PCR技術分析了棉花種質的親緣關系，結果表明，海島棉與草棉的A染色體組比較接近，而陸地棉與中棉的A染色體組相近，反映了異源四倍體與二倍體A基因組的進化關系。凌磊等[13]利用SRAP標記分析了彩色棉與白色棉的遺傳差異，研究結果表明，SRAP標記可以判明彩色棉和白色棉的遺傳差異，為彩色棉育種的親本選擇在分子水平上提供了一定的參考依據。棉花種群親緣關系的確定與分類研究，對于種質資源保護和新品種選育具有十分重要的戰略與現實意義。

3.2 遺傳多樣性研究和種質鑒定與評價

利用分子標記對棉花資源進行遺傳多樣性分析，可從表觀遺傳學深入到分子水平對它們進行研究和鑒定，以避免同種異名或同名異種的麻煩，發現新種質，保護瀕危種質，擴大基因資源庫，豐富育成品種的遺傳背景。陳光等[14]對不同親本來源、不同選育時期、不同種植生態區的43份陸地棉基礎種質進行了遺傳多樣性的SSR分子標記分析，研究結果顯示，與早期基礎種質資源相比，現代我國棉花基礎種質資源的遺傳多樣性呈下降趨勢，其中，黃河、長江主產棉區基礎種質的遺傳多樣性還沒有超過國外基礎種質，且品種間的遺傳背景較為狹窄。苗培明等[15]應用TRAP分子標記方法對65份棉花種質資源進行遺傳多樣性分析，所獲得的聚類結果與種質資源的地域來源和形態特征有一定的相關性，說明TRAP分子標記方法在棉花種質資源鑒定、分類等方面的研究上具有良好的應用前景。

因此，必須采用多種途徑來豐富我國棉花種質資源的遺傳多樣性，而通過遠緣雜交導入外源遺傳物質，是改良棉花遺傳基礎狹窄的一條重要途徑。但在引入外源染色體的同時，既有對作物改良有利的基因，也存在著大量的對作物改良不利的基因，這就需要一種準確、有效的分子標記技術（如 RFLP，RAPD，AFLP和 SSR 等）對其進行種質鑒定。賀道華等[16]用均勻分布于棉花全基因組的132個SSR標記，對精選的92個棉花品種（系）進行遺傳多樣性分析，結果表明，此自然群體的遺傳基礎較為寬泛，聚類分析和系譜追溯的結果顯示，該群體中品種的選育過程復雜，血統來源多樣，存在較高程度的遺傳多樣性。郭寶生等[17]利用9對引物對46個品種或品系的DNA進行擴增，結果表明，漸滲系主要遺傳背景為陸地棉，個別性狀來源于海島棉，由于漸滲位點和基因不同，從而造成一定的差異，被聚類到不同小組。

3.3 遺傳圖譜的構建

遺傳連鎖圖譜是指通過遺傳重組分析得到的基因在染色體上的線形排列圖。高密度分子標記遺傳連鎖圖譜的構建，可為基因定位、物理圖譜構建和以圖譜為基礎的目的基因克隆奠定基礎。到目前為止，在以RFLP，RAPD，SSR為主要分子標記技術構建的多張棉花遺傳連鎖圖譜的基礎上，林忠旭等[18]應用SRAP標記構建了棉花分子遺傳連鎖圖，作圖群體為邯鄲208與Pima90雜交產生的129個F2單株，篩選出多態性較好的76個引物組合進行檢測、構建連鎖群。近年來，還有人運用SSR，TRAP，SRAP和AFLP標記對四倍體栽培棉進行了高密度的遺傳圖譜構建和纖維品質性狀QTL定位，為大幅度增加棉花分子遺傳連鎖圖的密度提供了理論基礎。

3.4 QTLs的定位

目標基因是指在遺傳上真實存在的特殊性狀基因，如抗蟲、抗病、高產、優良品質性狀等基因。定位就是要把某一目標基因、質量性狀和數量性狀基因精確定位到染色體的具體位置上。汪保華等[19]通過對中棉所12與8891的雜交及多代自交，獲得180個家系構成的重組自交系F8和F9群體，采用SSR為主的分子標記構建了遺傳連鎖圖，并對株型性狀進行了單位點和雙位點水平的QTL定位。宋振云等[20]以亞紅株突變體PD-17與GK19配置的BC1群體為作圖群體，選用覆蓋棉花所有已鑒定染色體及大多數連鎖群的419對SSR引物，利用BSA（bulked segregation analysis）法篩選多態性差異引物，結果顯示，位于第7條染色體上的5個分子標記與Rs基因相連鎖，SSR標記BNL2634與Rs基因的遺傳距離較小，約為10.3 cM，SSR標記CIR393位于Rs基因另一側，與Rs基因的遺傳距離約為29.1 cM，由此將Rs基因定位于第7染色體上。董承光等[21]對無腺體突變基因G進行了精細定位，結合棉花海陸種間遺傳連鎖圖譜，利用SSR標記將G基因定位于 CIR362和 NAU2251b，NAU3860b，STV033之間，G基因與GIR362遺傳距離為9.27 cM，與 NAU2251b，NAU3860b，STV033 的距離為0.96 cM。

3.5 品種指紋圖譜的構建及品種（雜種）純度的鑒定

指紋圖譜是指能夠反映生物個體間差異的電泳圖譜，具有類似于人的指紋那樣的高度個體特異性和穩定可靠性。各種分子標記均可用于DNA指紋圖譜分析，其中，SSR和AFLP標記更為理想，所提供的多態性信息更為豐富，構建的DNA指紋圖譜可以進行品種鑒定、品種真實性和純度的檢測。王俊芳[22]用SSR標記構建了85份棉花種質的指紋圖譜，探討DNA指紋圖譜技術應用于棉花品種真實性和純度檢測的可能實現途徑。朱云國等[23]運用AFLP同位素標記技術，獲得了棉花細胞質雄性不育系、保持系、恢復系及其雜種F1的DNA指紋圖譜。姜偉等[24]利用ISSR對8個新疆棉花品種（系）進行了指紋圖譜構建，通過基因組多態性分析，從60條引物中篩選到11條擴增效果較好的引物，用其中2條引物UBC809，UBC841建立了8個品種的指紋圖譜。

3.6 分子標記輔助育種

作物新品種的選育過程中，選擇是最重要的環節之一，所謂的選擇是指在一個育種群體中選擇符合育種目標的基因型。傳統的作物育種方式是基于作物的表現型進行選擇的，具有很大的局限性。而分子標記輔助選擇是在DNA水平上進行，大大縮短了育種時間，可靠而高效，加快了育種進程。柳李旺等[25]利用CMS恢復基因Rf1緊密連鎖的3個SSR標記和Bt基因的PCR標記開展分子標記輔助選擇，培育聚合有Rf1和Bt的轉基因抗蟲棉恢復系，共獲得54個同時具Rf1與Bt基因的聚合單株。這些聚合單株自交后，通過標記輔助選擇，獲得10株含Bt基因且Rf1純合的單株。楊澤茂等[26]利用陸地棉栽培種CCRI221（中棉45）為受體，海島棉海1為供體，通過高代回交和分子標記輔助選擇相結合的方法，構建了1個由116個家系組成的染色體片段代換系群體，利用分布在棉花基因組25個連鎖群上的276個多態性標記對BC4F1進行檢測，結果顯示，在每個家系中代換片段最多的55個，最少的為15個，平均32.92個；覆蓋了棉花基因組180.7～969.0 cM，平均覆蓋502 cM。由于分子標記輔助育種不受棉花生長發育的時期及環境的影響，利用分子標記輔助育種已在棉花纖維品質育種、抗病育種等方面進行了廣泛研究[27-29]。

4 結論與展望

從分子標記技術在棉花育種中的研究進展和優缺點來看，DNA分子標記技術已成為棉花分子遺傳及輔助育種研究中的重要工具[30]。但是許多標記首先需要進行基因組克隆、測序、人工合成引物，開發費用相當高[31]，不能夠在棉花分子育種中得到廣泛的應用。

在未來的發展中，隨著大規模測序技術的應用，簡單快捷、穩定性好、成本低、更易于自動化的分子標記及各種標記的結合與相互轉化，必將在棉花分子遺傳育種的研究中發揮越來越重要的作用，并將極大地推動棉花育種的進程。

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