炎癥介質和細胞因子在急性腦缺血模型大鼠腸道細菌移位中的作用

劉 菁，王燕斌

(1華北電網有限公司北京電力醫院，北京100073;2首都醫科大學附屬北京天壇醫院)

大量的研究表明，嚴重創傷、燒傷、重癥胰腺炎、急性腦血管病等應激狀態下，患者的腸黏膜屏障(IMB)功能常發生變化，腸黏膜通透性升高，導致細菌移位，形成腸源性感染，是誘發全身炎癥反應綜合征(SIRS)甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)的根本原因［1］。我們在前期的研究中也觀察到急性腦缺血大鼠IMB的應激性變化［2］，但這一損傷發生的具體機制尚不清楚。2010年2～8月，本實驗擬通過對急性腦缺血大鼠門靜脈血內毒素(ET)、腫瘤壞死因子 α(TNF－α)以及腸黏膜組織中一氧化氮(NO)水平的變化與細菌移位關系的研究，探討急性腦血管病患者IMB功能應激性變化的發生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 64只12周齡健康雄性Wistar大鼠，體質量200～250 g，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所動物中心提供，隨機分為腦缺血模型組(模型組)和假手術對照組(對照組)。兩組大鼠分別于術后6、12、24和48 h進行相關指標觀察和測定，各時相點均為8只。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血模型的制備 大鼠實驗前12 h始禁食不禁水，模型組采用Kuge等［3］報道的線栓模型稍加改進。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(40 mg/100 g)，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開，逐層分離組織，暴露左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎左側頸總動脈近端、頸外動脈根部。在左側頸總動脈結扎處遠端剪一斜口，經此斜口插入尼龍絲，經左側頸總動脈分叉處通過頸內動脈入顱阻斷大腦中動脈的血流。尼龍絲插入深度為(18.5±0.5)mm。結扎頸內動脈以固定尼龍絲和防止出血，縫合皮膚，尼龍絲末端暴露在外。模型成功的標志為:手術麻醉蘇醒后，大鼠右側偏癱，右下肢伸直，站立不穩，向一側轉圈。對照組分離血管后除不插入尼龍絲外其余步驟與模型組相同。

1.2.2 血清ET和TNF－α的測定 各組動物處死前，在無菌條件下取門靜脈血1 ml，采用偶氮顯色法鱟實驗定量測定ET;雙抗體夾心ABC－ELISA法測定 TNF－α。

1.2.3 腸黏膜NO的測定 取末端回腸，剔除系膜，清除腸內容物后刮取黏膜組織200 mg，按需分別制成10%和1%的勻漿，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，硝酸還原酶法測定NO。

1.2.4 腸道細菌移位的測定 各組大鼠處死前6 h，管飼丫啶橙標記的大腸埃希菌(ATCC25922)菌液(1 ml/100 g體質量)。按各時間點活殺動物后，在嚴格無菌條件下取腸系膜淋巴結(MLN)、肺、脾、胰、肝、腎各0.1～0.3 g，制成10%的組織勻漿涂片。熒光顯微鏡下觀察標記細菌是否存在，計算檢出率。每個器官各時間點的檢出率=標記菌陽性的例數/該時間點總例數(8只);各組細菌總檢出率=標記菌陽性臟器總數/觀察臟器總數。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，結果用±s表示;組間比較采用非配對t檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ET、TNF－α及NO水平變化 見表1。

表1 兩組ET、TNF-α及NO水平變化(n=8，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

?

2.2 標記菌移位情況 對照組各時相點僅在MLN、肝和肺檢到少量熒光標記菌，術后 6、12、24、48 h標記菌總檢出率分別為2.1%、4.2%、2.1%和0，缺血組各臟器的標記菌檢出率顯著升高，術后6、12、24、48 h標記菌總檢出率分別為 11.4%、18.8%、25.0%和12.5%，P均＜0.05。

3 討論

生理情況下，結構完整的腸黏膜由于其完善的屏障功能能有效地阻止腸道內細菌侵入體內其他臟器，但在嚴重創傷、燒傷、手術、放化療等應激狀態或免疫抑制時，腸黏膜首當其沖受到影響。本實驗用測定熒光標記大腸桿菌移位的方法來反映腸黏膜的通透性，結果顯示，在急性腦缺血后早期，IMB功能已遭受破壞，導致腸黏膜通透性升高，從而使細菌移位明顯增加。

關于應激造成胃腸黏膜損傷的機制，國內外學者進行了大量研究，其中腸黏膜的低灌注、氧自由基損傷、細胞因子作用被認為是應激性胃腸黏膜病變的三大主要致傷因素。關于急性腦血管病后缺血缺氧以及氧自由基與IMB功能損傷的關系我們之前已作過報道［2，4］，本實驗主要針對細胞因子在這一病理生理過程中的作用進行研究。實驗中我們選取了ET、NO、TNF－α作為細胞因子和炎癥介質的代表［5～7］。本研究表明急性腦缺血后早期，ET水平即開始升高，隨之是TNF－α、NO等炎癥介質出現的高峰，之后，ET水平達到其峰值，同時標記菌的移位率也達到高峰，這與大多數研究中ET水平峰值先于細胞因子峰值出現的結果有所不同。我們分析認為，急性腦缺血后因為缺血缺氧等因素造成IMB功能一定程度的損傷，ET開始入血，之后激活單核—巨噬細胞系統產生大量的TNF－α，以自分泌和旁分泌的方式在局部起作用，從而誘導其他炎癥性介質的產生和釋放，如 IL－1、IL－6、IL－8 等，擴大其生物學效應［8］。而此時形成的炎癥介質和細胞因子的高峰，使IMB功能進一步受損，隨之而來的是大量ET的集中入血和腸道細菌移位，形成循環中ET的高峰，參與此過程的炎癥介質和細胞因子構成網絡，彼此促進相互疊加，如此惡性循環推動了SIRS/MODS的發生發展，這基本符合“二次打擊”的理論［9］。

總之，腸道是應激反應的中心器官，它不僅是MODS的靶器官，更是MODS的發動者。積極干預急性腦缺血后腸黏膜的應激性變化，維護IMB功能，防止ET和細菌移位，抑制細胞因子的產生和釋放，在阻斷急性腦血管病患者SIRS甚至MODS的發生，改善其預后有重要的臨床意義。

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