近紅外光譜技術(shù)對(duì)膠質(zhì)瘤大鼠優(yōu)化散射系數(shù)的研究

郭 凱，楊天明*，錢(qián)志余，張立國(guó)，劉華亭

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京210009;2南京航空航天大學(xué))

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤(約占30%)。目前膠質(zhì)瘤的無(wú)創(chuàng)定位方法主要是MRT、CT、PET，然而膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)并與腦組織無(wú)明顯分界，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法所檢測(cè)到的腫瘤邊界隨著術(shù)中腦位置變化和腦脊液改變而變化，因此，為盡可能切除腫瘤細(xì)胞需要開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)方法來(lái)更好地定位腫瘤范圍［1，2］。近紅外光譜技術(shù)將空間分辨率提高到單細(xì)胞分子水平，以無(wú)創(chuàng)或微侵襲、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)逐漸應(yīng)用于臨床腫瘤的診斷。本實(shí)驗(yàn)于2010年3～11月利用近紅外光譜采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)在位采集C6膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)，通過(guò)對(duì)其分析來(lái)判斷腦組織類型，為膠質(zhì)瘤研究提供一種新的實(shí)時(shí)診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 江灣I型C動(dòng)物立體定向儀，微創(chuàng)近紅外組織參數(shù)測(cè)試系統(tǒng)，特制的Y型雙光纖微探頭，鹵素光源，光譜儀，自動(dòng)步進(jìn)系統(tǒng)，MID－7604步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器，PCR－7344控制器，計(jì)算機(jī)及相關(guān)軟件。

1.2 細(xì)胞與動(dòng)物 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為加入15%馬血清及2.5%胎牛血清的F－12K培養(yǎng)液。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大約滿85%時(shí)，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，F(xiàn)－12k液洗2次后制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107～1 ×108/10 μl，置于 33 ℃恒溫?fù)u床待接種。苔盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95%。選取健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(購(gòu)自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心)40只，體質(zhì)量250 g，雌雄不限，隨即選取20只建模，另外20只作為正常對(duì)照組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤大鼠模型的建立及鑒定 大鼠術(shù)前12 h禁食禁水，麻醉前30 min肌肉注射阿托品0.05 mg以抑制呼吸道分泌，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每小時(shí)肌肉注射阿托品0.05 mg維持。腹腔注射1%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，體溫控制在37.5℃。麻醉后將大鼠固定于江灣Ⅰ型立體定向儀上，暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)，向后1 mm、中線向右旁開(kāi)3.0 mm，用牙科磨鉆打一直徑1 mm小孔。微量進(jìn)樣針將10 μl細(xì)胞懸液緩慢注入硬腦膜下5 mm處的腦組織中，停針5 min后退針，骨蠟封閉骨孔，清洗切口后縫合。常規(guī)飼養(yǎng)14 d后將大鼠用常規(guī)劑量戊巴比妥鈉麻醉，用7.0 T德國(guó)bruker公司生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物專用磁共振儀行平掃。

1.3.2 膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)測(cè)定 將膠質(zhì)瘤組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定于立體定向儀框架，將三維坐標(biāo)調(diào)零。常規(guī)消毒后切開(kāi)頭皮約1.0 cm，剝離骨膜，用牙科磨鉆在原建模時(shí)的骨孔處打一直徑3 mm的小孔，利用生物組織近紅外光譜自動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)，在骨孔處進(jìn)行近紅外光學(xué)參數(shù)測(cè)量。微創(chuàng)光纖探頭以硬腦膜為測(cè)試零點(diǎn)，并在立體定向儀的定位和步進(jìn)電機(jī)控制下開(kāi)始活體在位測(cè)量相關(guān)參數(shù)(測(cè)量步長(zhǎng)0.1 mm，測(cè)量深度約6 mm)。測(cè)量結(jié)束后緩慢退出近紅外探頭，鉆孔使用骨蠟覆蓋，常規(guī)縫合傷口，整個(gè)過(guò)程在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，術(shù)后無(wú)需抗生素防治感染，術(shù)后對(duì)大鼠行MRI掃描。掃描后麻醉處死大鼠，取腦固定于10%福爾馬林溶液24 h以上，石蠟包埋，切片，HE常規(guī)染色。正常對(duì)照組大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)測(cè)定步驟同上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠腦組織可以清晰看出微創(chuàng)光纖探頭從硬腦膜開(kāi)始經(jīng)皮層、白質(zhì)然后到達(dá)基底節(jié)區(qū)。膠質(zhì)瘤腦組織可看到膠質(zhì)瘤呈橢圓形侵犯整個(gè)右側(cè)基底節(jié)區(qū)域及白質(zhì)部分，并越過(guò)中線擠壓左側(cè)基底節(jié)區(qū)域的腦組織而且伴有腦水腫。

2.2 HE染色結(jié)果 膠質(zhì)瘤大鼠處死后取腦切片行HE染色，左側(cè)藍(lán)染區(qū)域可見(jiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞聚集，右側(cè)淡染區(qū)域?yàn)檎＝M織并明顯可見(jiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 優(yōu)化散射系數(shù)測(cè)量結(jié)果 膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)一維曲線較為平直、穩(wěn)定。在波長(zhǎng)690 nm處對(duì)照組和C6膠質(zhì)瘤組優(yōu)化散射系數(shù)分別為(19.86±0.86)、(17.69±1.70)cm－1(P ＜0.05)。

3 討論

近紅外光譜技術(shù)是近幾年發(fā)展的一種檢測(cè)組織結(jié)構(gòu)性質(zhì)和動(dòng)態(tài)功能的新技術(shù)。目前應(yīng)用于多種病理生理狀況下腦組織的監(jiān)測(cè)，但是大多是用于監(jiān)測(cè)腦組織血流動(dòng)力學(xué)改變或腦氧代謝，用于腦組織類型的精確識(shí)別及病理情況下檢測(cè)的研究較少。楊天明等利用近紅外光譜技術(shù)通過(guò)探頭穿刺過(guò)程中的近紅外光反射系數(shù)R推算腦組織光學(xué)參數(shù)，證實(shí)了腦灰質(zhì)與腦白質(zhì)間光學(xué)特性有差異。相對(duì)于正常腦組織，腦膠質(zhì)瘤含有較低的脂質(zhì)及大量的髓鞘增生［1］。腫瘤的生物學(xué)行為受諸多因素影響，如瘤體的血管生成和能量代謝等。瘤體的形成過(guò)程中，血管生成因子過(guò)度表達(dá)，血管生成迅速，部分管壁不完整甚至出血壞死［3］。而腫瘤的能量代謝分為有氧代謝和無(wú)氧代謝，Ⅱ～Ⅲ級(jí)C6膠質(zhì)瘤多為有氧代謝，能量代謝率較高［4］。因此，當(dāng)腦組織結(jié)構(gòu)及組成成分發(fā)生變化時(shí)對(duì)光的散射特性也會(huì)出現(xiàn)變化，優(yōu)化散射系數(shù)可反應(yīng)出這種變化。優(yōu)化散射系數(shù)既是組織結(jié)構(gòu)的固有光學(xué)特征，又能反映與神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)的變化，且受組織內(nèi)血流量、血紅蛋白及水含量等影響小，與吸收系數(shù)相比數(shù)值相對(duì)穩(wěn)定，宜作為組織定位時(shí)的特征參數(shù)。在高散射介質(zhì)的生物組織中(如腦組織)優(yōu)化散射系數(shù)遠(yuǎn)大于吸收系數(shù)，故優(yōu)化散射系數(shù)更穩(wěn)定，對(duì)變化更敏感。

本實(shí)驗(yàn)我們用特制的內(nèi)置雙光纖微針管樣探頭［5，6］微創(chuàng)實(shí)時(shí)在位監(jiān)測(cè)C6荷瘤鼠腦基底節(jié)區(qū)腫瘤的優(yōu)化散射系數(shù)，并與對(duì)照組比較，結(jié)果表明C6荷瘤鼠基底節(jié)區(qū)腫瘤的優(yōu)化散射系數(shù)明顯低于對(duì)照組。由此證實(shí)近紅外光譜技術(shù)對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷具有安全可靠、連續(xù)實(shí)時(shí)、便捷、低成本、無(wú)創(chuàng)、操作時(shí)程短和對(duì)人體生理狀態(tài)影響小等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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