豬圓環病毒檢測方法的研究進展

苗麗娟

（吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101）

豬圓環病毒（PCV）為圓環病毒科圓環病毒屬，是迄今發現的最小的動物DNA病毒。該病毒基因組為單股環狀DNA，無囊膜，粒子呈20面體對稱，直徑17～20 nm。根據PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性，將PCV分成PCV1和PCV2兩種基因型。PCV1無致病性，PCV2具有致病性。PCV2與近年來在世界各國普遍發生的PCV感染密切相關。該病主要以進行性消瘦和多系統病理損傷為特征，已給全球養豬業造成相當嚴重的經濟損失。PCV2還可以造成育肥豬皮炎與腎炎綜合征，并與懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫、新生仔豬腹瀉病、增生性壞死性肺炎的發生密切相關。隨著該病的出現，人們越來越重視對豬圓環病毒的研究[1]。

PCV在臨床癥狀上容易與一些疾病混淆，如豬瘟等。僅通過臨床癥狀、病理剖檢很難做出準確診斷，因此實驗室診斷方法是PCV的重要診斷方法。診斷PCV的方法大致分成血清學方法與分子生物學方法兩類。血清學診斷方法包括免疫組織化學檢測（IHC）、酶聯免疫吸附方法（ELISA）和間接免疫熒光（IFA）等。分子生物學診斷方法包括PCR、RT－PCR和熒光定量PCR等，是通過檢測組織病料及病毒培養物中的病毒核酸來判斷的，還可以采用病毒的分離與鑒定的方法。

1 病毒的分離與鑒定

將病死豬組織（肺、淋巴結等）與PBS 1∶5研磨，凍融3次，8 000 rpm離心15min，取上清。接種于無PCV污染的PK－15細胞，同時加入1/10體積的300mmol·L－1D－氨基葡萄糖。通常在病料接種后3 d，通過IFA、PCR或電子顯微鏡觀察等方法確認病毒分離情況。病毒分離費時費力，不適于疾病的快速診斷。

2 血清學方法

2.1 酶聯免疫吸附方法

酶聯免疫吸附方法（ELISA）是以抗體抗原反應為原理的技術，是繼免疫熒光和放射免疫技術之后產生的一種檢測抗體或抗原的免疫酶技術，該技術簡單、靈敏、快速。血清學方法中最主要的是ELISA法，主要包括競爭ELISA、間接ELISA、抗原捕獲ELISA等。

2.1.1 競爭ELISA

競爭ELISA主要用于測定小分子抗原及半抗原。用特異性抗體致敏固相載體，加入含待測抗原的樣品及一定量的酶標抗原共同培養，洗滌除去標記和未標記的抗原，加底物顯色。Walker等首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA（c－ELISA）方法來檢測PCV2抗體，并將這種方法和IFA方法相比，檢測結果表明，該方法比IFA更敏感，可用于PCV2抗體的大規模檢測[2]。

2.1.2 間接ELISA

間接ELISA主要用于測定抗體。用抗原致敏固相載體，然后加入待測抗體的血清，培養后洗去未結合成分，再加入酶標抗體，洗滌后加入底物，在酶的催化下底物發生反應，產生有色物質。Nawagitgul等報道了兩種間接ELISA法，一種以細胞培養的PCV2全病毒作為抗原（PCV2－ELISA），另一種以ORF2重組桿狀病毒表達產物作為包被抗原（ORF2－ELISA），分別用于檢測針對全病毒和病毒核衣殼蛋白的抗體。試驗結果顯示，ELISA方法敏感性高、重復性好，并且與PPV及PRRSV的抗體無交叉反應[3]。但是，由于PCV2 ELISA不能有效區分PCV1與PCV2抗體，并且PCV2病毒培養物滴度低，純化困難，因此該方法的應用受到很大限制。

2.1.3 抗原捕獲ELISA

有研究人員利用單抗建立了抗原捕獲ELISA方法檢測PCV2特異抗體。McNeilly等以PCV2特異性單抗為工具建立了抗原捕獲ELISA用于仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的診斷，發現抗原捕獲ELISA與病毒分離、IHC一樣能很好地鑒別PMWS與PCV2的亞臨床感染[4]。抗原捕獲ELISA的建立為PMWS與PCV2的亞臨床感染的鑒別診斷提供了很好的手段。

2.2 間接免疫熒光

間接免疫熒光（IFA）主要利用已知抗原來檢測待檢血清的抗體，用于病毒分離效果的鑒定及病變組織或豬源細胞PCV感染情況的檢測。陳慶新等將浙江省杭州地區28個豬場采集豬血清1 677份用IFA試驗進行PCV2的抗體檢測，檢測出陽性血清960份，陽性率為55.48%，調查結果顯示，杭州地區豬場為普遍感染[5]。這種方法成本低、簡單、快速、靈敏，但實際操作復雜，因此不適合臨床上的快速診斷。

2.3 免疫組織化學檢測

免疫組織化學檢測（IHC）與IFA一樣，也是一種免疫染色方法，是在抗原抗體特異性反應的前提下，利用酶細胞化學的手段，檢測抗原或抗體的一門新技術。IHC是可以對攜帶抗原的細胞及組織的形態進行大體的評價，而且在普通顯微鏡下就可以進行觀察，且顏色穩定，樣本易保存。有學者應用IHC法對PMWS患病豬的淋巴組織進行了檢測，發現淋巴組織中單核巨噬細胞內和組織細胞內PCV2的陽性信號很強，說明PCV2主要存在這些細胞的細胞漿內。

2.4 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）是將生長有PCV病毒的PK－15細胞在96孔板上長成單層后，加入10倍稀釋的待檢豬血清，作用一定時間后吸干洗滌，再加入HRP標記的抗豬IgG，37℃孵育30min，吸干洗滌后加入底物溶液顯色，然后終止反應。劉長明等在優化此檢測方法的基礎上，研制出一種新的IPMA抗體檢測試劑盒，該試劑盒用于豬血清中PCV－2抗體檢測，具有特異、敏感、操作簡便、實用性強等特點[6]。

3 分子生物學診斷方法

主要應用分子生物學方法來檢測組織病料或培養物中的病毒核酸。

3.1 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應（PCR）是一種快速、簡便、特異的診斷方法，可直接檢測病毒核酸，在獸醫臨床檢測病原中廣泛應用。經過多年研究，已建立了多種形式的PCR方法，主要包括常規PCR、多重PCR、套式PCR、熒光定量PCR及PCR－RFLP等方法。

3.1.1 常規PCR

常規PCR是通過設計合成一對特異性引物，直接從病料或細胞中擴增PCV2特異的基因組片段，以達到特異檢測PCV2的目的。Morozov從PCV－PK－15DNA鏈上設計特異性引物進行PCR反應，可直接檢測組織病料及其細胞培養物中的病毒核酸。

3.1.2 多重PCR

多重PCR是一種特殊的PCR技術，主要是通過在同一反應中加入多對引物從而同時檢測2種或2種以上病毒DNA。由于這種方法方便、快捷，已經廣泛應用于醫學臨床，給疾病的快速診斷帶來了方便。

3.1.3 套式PCR

套式PCR克服了由于組織病料或細胞中的PCV2模板DNA含量太少，而不能檢測到PCV2基因組存在的特點。方法是設計兩套引物，先用第1套引物進行PCR，然后取少量PCR產物作為模板，用第2套引物即套式引物再進行PCR。套式PCR較常規PCR及復合PCR更為敏感。

3.1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR方法具有良好的特異性和重現性，與普通PCR相比，特異性和靈敏度都更高一些，而且能夠有效減少試驗過程中產生的污染，便于觀測，能實時地監測反應全過程。羅玉均等建立了TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測PCV－2[7]。

3.1.5 PCR－RFLP分析方法

PCR－RFLP是指先以PCR快速而有效的擴增微量DNA，再利用限制酶進行多態性分析的試驗方法。王新等借助RFLP方法對PK－15細胞、IBRS－2細胞以及疑似PMWS、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）的病料進行了PCV檢測以及血清型的鑒定[8]。

3.2 原位雜交

原位雜交（ISH）是利用核酸分子單鏈之間互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵形成穩定的雜交雙鏈。ISH具有敏感性高和精確定位PCV病毒或PCV及PRRSV病毒DNA或RNA在細胞中的部位的特點，為進一步深入研究PCV的致病機理及與PPV或PRRSV之間的協同效應提供了幫助。肖馳等建立了CSF－PRRS－PCV2診斷DNA芯片，能同時檢測 PRRS、CSF和PCV－2感染[9]。

4 小結

目前PCV2和其相關的疾病已在全世界范圍內發生和流行，給養豬業造成了嚴重的威脅，引起了國內外學者的廣泛關注。因此，建立一種簡單、靈敏、經濟、實用，適合臨床推廣的快速檢測方法仍是目前研究的主要任務和方向。雖然目前檢測PCV的方法很多，但各種方法都有其自身的局限性，因此要根據試驗的目的要求，結合具備的條件選擇適宜的檢測方法檢測PCV，做到早發現，早治療，力爭從根本上解決該病的防控問題。

[1]郭春艷,葛俊偉,李一經.豬圓環病毒2型ORF2基因的原核表達[J].東北農業大學學報,2009,40（6）:79－84.

[2]Walker IW,Konoby CA,Jewhurst V A,et al.Developmentand application of a competitive enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2[J].JVet Diagn Invest,2000,12（5）:400－405.

[3]Nawagitgul P,Harms PA,Morozov I,etal.Modified indirect Porcine Circovirus（PCV）type 2－based and recombinant capsid protein（ORF2）－based enzyme－linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV[J].Clincal and Vaccine Immunology,2002,9（2）:33－40.

[4]McNeilly F,McNair I,O′Connor M,et al.Evaluation of a porcine circovirus type 2 specific antigen capture enzyme－linked immunosorbent assay for the diagnosis of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs:Comparison with viius isolution,immunohistochemistry,and the polymerase chain reaction[J].JVet Diagn Invest,2002,14（2）:106－112.

[5]陳慶新,商紹彬,葉菊秀,等.杭州地區豬Ⅱ型圓環病毒抗體的血清學調查[J].中國獸醫科技,2003,33（7）:26－28.

[6]劉長明,張超范,危艷武,等.豬圓環病毒2型免疫過氧化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研制及應用[J].中國預防獸醫學報,2007,29（8）:621－624.

[7]羅玉均,張桂紅,陳建紅,等.Taqman探針熒光定量PCR快速檢測豬圓環病毒2型[J].中國獸醫雜志,2007,43（1）:77－79.

[8]王新,郭萬柱,徐志文,等.應用PCR－RFLP方法對四川豬圓環病毒的檢測與分型研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2006（6）:77－83.

[9]肖馳,曹三杰,文心田,等.PRRS－CSF－PCV2診斷DNA芯片構建研究[J].畜牧獸醫學報,2006,37（8）:799－803.