惡性腦膠質瘤U87細胞系腫瘤干細胞放療敏感性的體外實驗研究

趙紅宇，徐 東，李 帥，王 倩，劉海君，金 輝，劉云會*

(1中國醫科大學盛京醫院，沈陽110004;2中國醫科大學臨床醫學系;3中國醫科大學臨床藥理實驗室)

惡性腦膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，其惡性程度極高，占中樞神經系統腫瘤的60%以上;臨床上患者雖經放療、化療及手術等干預治療，但其病死率仍居高不下，中位生存期僅14.6個月［1］。近年研究表明，腦膠質瘤內存在小的細胞亞群——腫瘤干細胞(CSCs)，其具有神經干細胞(NSCs)特性，能進行自我更新、多向分化及體內致瘤，是腫瘤發生、發展的根源［2］。在腦膠質瘤 CSCs成功分離與鑒定的基礎上，不斷有學者提出CSCs的治療策略［3］。2007～2008年，我們在成功分離、鑒定 U87惡性腦膠質瘤CSCs的基礎上，檢測了腦膠質瘤細胞系U87細胞及其CSCs的體外放療敏感性，旨在探討CSCs在惡性腦膠質瘤放療抵抗性中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 腦膠質瘤細胞系U87細胞(中國科學院)，DMEM/F12培養液(Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)。NSCs標記物鑒定試劑盒，NSCs表面標記物小鼠抗人CD133單抗、小鼠抗人Nestin單抗、小鼠抗人微管相關蛋白2(MAP2)單抗、兔抗人膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)多抗、小鼠抗人O1單抗，Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87細胞培養和傳代 將U87細胞接種于含10%FBS的DMEM/F12培養基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。5～7 d后，按1∶2或1∶3比例傳代。

1.2.2 CSCs培養和傳代 將U87細胞接種于含B27、肝素、表皮生長因子、堿性成纖維生長因子的無FBS的DMEM/F12培養液中，在 37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。待U87細胞增殖形成細胞球3～4 d后，吸取上清培養液 (含細胞球)，重新吹打成單細胞懸液，按1∶2或1∶3比例傳代。

1.2.3 CSCs鑒定 原代細胞球形成并達到100～200個細胞后，收集其細胞球，用0.1%胰蛋白酶和1×EDTA在37℃下處理10 min，細胞球分解成單細胞后，轉移到96孔培養皿進行培養;稀釋細胞懸液為1～2個細胞/孔，觀察單細胞克隆能力。將細胞離心后種植于盒式載玻片中，以2%多聚甲醛固定，室溫15 min;10%驢血清封閉，室溫1 h。以NSCs標記物鑒定試劑盒進行細胞染色，室溫孵育2 h;加入Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。在顯微鏡下隨機選擇20個高倍視野進行陽性CSCs計數。

1.2.4 實驗分組及照射干預 將傳代的U87細胞及CSCs均以隨機數字法設立對照組與照射組，對照組不進行照射;照射組分為 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy 劑量組，均在室溫下用西門子Primus-M型直線加速器進行照射。

1.2.5 集落形成實驗 分別收集兩種細胞制成懸液，加入24孔培養皿中，每培養皿接種400個細胞。對照組及照射組細胞均在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養7 d后，用95%乙醇固定、0.25%結晶紫染色，并計數≥50個細胞的集落，計算集落形成率及細胞存活分數(SF，SF=照射組集落形成率/對照組集落形成率)。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，組間率的比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U87細胞生長及CSCs形成、增殖 在FBS的DMEM/F12培養基中，U87細胞呈貼壁生長并交織成網狀;轉移到無FBS的NSCs培養基中培養5～7 d后，少部分細胞自我增殖呈球狀或卵球狀懸浮的細胞球克隆，每細胞球有100～200個細胞。初代細胞球細胞分解成單細胞后，重新在NSCs培養液中培養，其細胞均能形成2代細胞球。

2.2 CSCs鑒定 細胞球細胞表達NSCs的表面標記物 CD133、Nestin，而不表達星形細胞標記物GFAP和神經元標記物MAP2，極少表達少突膠質細胞標記物O1。多數分化細胞表達GFAP，少數表達MAP2和 O1。

2.3 X線照射對U87細胞及CSCs的影響 照射組照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy劑量時，U87細胞及CSCs的存活率分別由1%逐漸降至0、0.2%。隨著照射劑量增加，U87細胞及CSCs的存活率均下降(P＜0.01)，且CSCs的存活率高于U87細胞(P＜0.01)。

3 討論

近年研究表明［4，5］，惡性腦膠質瘤內具有 NSCs特性的細胞亞群CSCs，在腫瘤發生、發展中發揮了決定性作用。這些細胞在體外可形成克隆球，具有多向分化及體內致瘤能力。本研究結果顯示，惡性腦膠質瘤細胞系U87細胞及CSCs接受X線照射后，其細胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加而細胞存活率逐漸下降;并發現在同一劑量放射線干預下，U87細胞的存活率明顯低于CSCs。表明U87細胞系CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，CSCs具有明顯的放療抵抗性。

目前，應用傳統的抗腫瘤放療手段雖能抑制腫瘤細胞增殖，但其作用短暫，且腫瘤容易復發。近年研究認為，因CSCs較其他分化的腫瘤細胞具有更強的放療抵抗性，故放射線干預僅能殺滅或抑制腫瘤中的非腫瘤干細胞，而對其CSCs則較少或無治療作用［6］。本研究結果證實了這一現象。

放射生物學理論認為，DNA作為放射線對細胞作用的關鍵靶點，在放療機制中發揮重要的作用;DNA損傷程度反映放療敏感性的強弱，DNA損傷后迅速修復是放療抵抗性的關鍵原因［7］。Bao等［8］研究發現，在放射劑量干預下，CSCs的存活比例明顯高于腫瘤細胞;并發現CSCs的放療抵抗性增高是通過首先激活檢查點蛋白實現的，應用檢查點激酶的特異性抑制劑能抑制CSCs的DNA損傷修復，逆轉CSCs的放療抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能與影響細胞周期調控及信號轉導通路改變有密切關系。

綜上所述，根據CSCs的放療抵抗特性，尋找特異性針對CSCs的治療手段，可能從根本上遏制腫瘤生長;探索針對CSCs的放射增敏，將成為腫瘤放療極具前途的發展方向。

［1］Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus con2comitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma［J］.N Engl J Med，2005，352(10):9872-9996.

［2］蘇進，許新華.腫瘤干細胞生物學特性及相關研究進展［J］.腫瘤防治研究，2010，37(4):474-476.

［3］張勝平，黃金，鄧興力，等.腦膠質瘤干細胞基因靶向治療研究［J］.國際神經病學神經外科學雜志，2010，37(1):25-28.

［4］李明武，牛朝詩，董永飛，等.腦腫瘤干細胞的增殖活性與病理級別的相關性研究［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2009，8(6):542-546.

［5］Ehtesham M，Mapara KY，Stevenson CB，et al.CXCR4 mediates the proliferation of glioblastoma progenitor cells［J］.Cancer Lett，2009，274(2):305-312.

［6］Johannessen TC，Bjerkvig R，Tysnes BB.DNA repair and cancer stem-like cells-potential partners in glioma drug resistance［J］.Cancer Treat Rev，2008，34(6):558-567.

［7］谷銑之，殷蔚伯，余子豪，等.腫瘤放射治療學［M］.4版.北京:中國協和醫科大學出版社，2008:231-232.

［8］Bao S，Wu Q，McLendon RE，et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response［J］.Nature，2006，444(7120):756-760.