厄洛替尼聯合RNAi對人肺腺癌A549細胞凋亡及survivin表達的影響

谷 蕾，呂喜英

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

厄洛替尼是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，用于化療方案失敗的局部晚期或轉移的非小細胞肺癌(NSCLC)的二線治療。由于其不良反應少、耐受性好，在肺癌的治療中日益受到關注。但由于最終幾乎所有患者都會產生耐藥，限制了其長期療效［1］。厄洛替尼聯合標準含鉑一線化療方案不能額外改善生存率［2］，因此，需要找尋能提高腫瘤細胞對厄洛替尼敏感性、增強厄洛替尼抗腫瘤作用的方法。survivin蛋白是至今發現作用最強的凋亡抑制蛋白(IAPs)。研究發現，survivin除能夠抑制細胞凋亡、促進細胞增殖外，還參與腫瘤細胞的耐藥［3］。2009年9月～2011年3月進行本研究，旨在探討厄洛替尼聯合survivin siRNA轉染對人肺腺癌A549細胞凋亡的影響及對survivin基因的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 p53野生型肺癌細胞株A549由河北醫科大學第四附屬醫院提供;survivin siRNA、control siRNA-A、siRNA轉染試劑、siRNA轉染培養基、鼠抗人survivin蛋白單克隆抗體、鼠抗人β-actin一抗均為Santa Cruz公司產品;羊抗鼠二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;BCA蛋白定量試劑盒為北京普利萊公司產品;Annexin V-EGFP購于南京凱基生物科技發展有限公司;厄洛替尼購于上海羅氏制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及實驗分組 將A549細胞接種在50 ml培養瓶中，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱內傳代培養，取指數生長期細胞進行實驗。實驗分為5組:空白對照組:不進行任何處理;control siRNA轉染組:轉染control siRNA-A(一種不針對20～25 nt siRNA設計的siRNA序列，作為特異基因轉染的陰性對照);survivin siRNA轉染組:轉染survivin siRNA;厄洛替尼處理組:加入厄洛替尼(12.5 μmol/L);survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組:轉染survivin siRNA并加入厄洛替尼。

1.2.2 細胞轉染及藥物處理 細胞以2×105/孔接種于6孔板中，至細胞融合約60% ～80%時，按說明書進行轉染，分別用survivin siRNA及陰性對照siRNA(即control siRNA-A)轉染A549細胞，同時設立未轉染A549細胞為空白對照組和厄洛替尼處理組。轉染后6 h換液，各組分別加入含或不含厄洛替尼(12.5 μmol/L)的10%新生牛血清的 RPMI 1640培養液，繼續培養48 h。

1.2.3 流式細胞技術檢測細胞凋亡 培養48 h后收集細胞，1 500 r/min離心10 min，調整細胞濃度為1×107/ml，取2×105個細胞，分別加入Annexin V-EGFP 3 μl、PI 5 μl、Buffer 400 μl，室溫避光反應15 min后在流式細胞儀上檢測各組細胞存活率。

1.2.4 Western blot法檢測 survivin 蛋白的表達用含有PMSF的細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA蛋白質濃度測定試劑盒進行蛋白質定量。取等量蛋白上樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，室溫封閉2 h，加入一抗(鼠抗人survivin一抗1∶100，鼠抗人 β-actin一抗1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(羊抗鼠二抗1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，化學熒光法顯色，暗室曝光顯影。實驗重復3次。圖像用灰度掃描軟件BandScan 4.5進行灰度分析，用survivin蛋白灰度值與β-actin灰度值比值進行統計分析。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行統計分析，數據以±s表示，進行單因素方差分析及2×2析因設計的方差分析，組間比較采用q檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡檢測結果 空白對照組、control siRNA轉染組、厄洛替尼處理組、survivin siRNA轉染組、survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組細胞凋亡率分別為(0.860 ±0.606)%、(3.763 ±1.172)%、(48.913 ±1.221)%、(22.513 ±0.975)%、(54.618±1.644)%。與空白對照組及control siRNA轉染組相比，survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組細胞凋亡均明顯增加(P均＜0.05)，survivin siRNA轉染與厄洛替尼聯合作用較二者單獨作用細胞凋亡更加明顯(P均＜0.05)。

2.2 survivin蛋白表達結果 空白對照組、control siRNA轉染組、survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組、survivin siRNA+厄洛替尼處理組的survivin蛋白灰度值/β-actin灰度值分別為0.988±0.016、0.953 ±0.025、0.687 ±0.049、0.559 ±0.054、0.405±0.029。與空白對照組及control siRNA轉染組相比，survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組survivin蛋白的表達均受到抑制(P均＜0.05)，survivin siRNA轉染與厄洛替尼聯合作用較二者單獨作用對survivin蛋白表達的抑制作用更明顯(P均＜0.05)，空白對照組與control siRNA轉染組之間差異無統計學意義。

3 討論

survivin蛋白是IAPs家族中分子量最小的成員，研究表明survivin蛋白在包括肺癌在內的多數惡性腫瘤細胞中高表達，而在相應正常組織中不表達。在肺癌組織中survivin高水平表達與腫瘤分級分期高、淋巴結轉移、血管侵犯密切相關［4，5］。由于其表達的特異性及對細胞增殖和凋亡的雙重作用，使其成為肺癌基因診斷、治療和預后研究的理想靶目標。并且，大量研究顯示survivin參與腫瘤細胞耐藥機制［6，7］。厄洛替尼是屬于口服的酪氨酸激酶拮抗劑，通過阻斷NSCLC細胞生長、增殖過程中的某些信號轉導通路而發揮其抗腫瘤作用。但是近年來的研究發現，EGFR突變與NSCLC對此類EGFRTKI的敏感性有關，限制了其臨床應用，耐藥的產生也限制了其長期療效。

研究發現，血管內皮生長因子(VEGF)的抗凋亡作用主要是通過誘導survivin在內皮細胞中高表達而實現的［2］。VEGF是調節血管生成最主要的生長因子之一，并且受EGFR調控。本研究發現，應用厄洛替尼處理后的A549細胞較未經處理的正常A549細胞凋亡增加，survivin蛋白的表達水平明顯降低，其機制可能是厄洛替尼競爭性結合EGFR使EGFR對VEGF的調控能力降低，從而降低了VEGF導致的survivin高表達;survivin在細胞G2/M期呈高表達，應用厄洛替尼后可使癌細胞阻滯于 G1期［8］，不能進入survivin高表達的 G2/M期，從而降低survivin蛋白表達水平，促進細胞凋亡。survivin siRNA轉染和厄洛替尼聯合作用時較厄洛替尼單獨作用對細胞凋亡的促進作用更明顯，證明通過轉染survivin siRNA沉默survivin的表達可增加細胞對厄洛替尼的敏感性，可能是上述作用與survivin siRNA特異性抑制survivin表達共同作用的結果。本研究還發現，survivin siRNA轉染和厄洛替尼處理兩種因素存在交互作用，并且表現為拮抗作用，二者的相互作用有待于進一步研究。

綜上所述，本實驗結果為提高厄洛替尼對NSCLC的治療效果帶來了新希望，為臨床提供了新的治療NSCLC的思路和實驗依據。

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