肺癌細胞裂解物負載對樹突狀細胞分泌的exosome誘導抗腫瘤作用的影響

張在云，李希德，劉 葉，王志侖，潘祥林

(1山東大學第二醫院，濟南250033;2高密縣中醫院)

生物免疫治療是腫瘤治療的重要手段，胞外體(exosome)是多種細胞分泌到細胞外的小囊泡，具有抗原呈遞和誘導抗腫瘤免疫作用［1］。近年來exosome腫瘤疫苗受到廣泛關注，成為目前腫瘤免疫治療研究的熱點。樹突狀細胞(DC)是目前所知功能最強的抗原呈遞細胞，DC來源的exosome含有抗原呈遞分子及豐富的共刺激分子，與腫瘤抗原結合能激發抗腫瘤作用［2］。腫瘤細胞裂解物含豐富的細胞成分，用細胞裂解物刺激能否增強exosome誘導的抗腫瘤作用尚不清楚。2009年10月～2010年10月，我們觀察了肺癌細胞裂解物負載對DC分泌的exosome抗腫瘤作用的影響，旨在為制備高效的exosome腫瘤疫苗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養基(Gibco公司);GM-CSF(先靈葆雅公司);IL-4(R＆D 公司);TNF-α(R＆D 公司);CD1a、CD80及 CD83抗體(Immunotech公司);MTT(Sigma公司);超濾離心管(Millipore公司);鼠抗人 HSP70、HLA、CEA 抗體、兔抗鼠 IgG、ECL(Santa Cruz公司);A549肺癌細胞株為本實驗室保存。流式細胞儀(Beckman-coulter公司);超聲波細胞粉碎儀(寧波新科公司);超速冷凍離心機(日立公司);透射電鏡(Philips公司);酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2 肺癌細胞裂解物負載DC的制備及鑒定 分離外周血單個核細胞，貼壁培養2 h，用尼龍毛自非貼壁細胞分離T細胞，備用。貼壁細胞用含GMCSF(1 000 U/ml)及IL-4(500 U/ml)的培養基培養，第5天起加用TNF-α100 U/ml。倒置顯微鏡下見細胞表面出現突起及毛刺，表現為典型DC形態。第10天收集DC，調整細胞數為每管1×106個，加入CD1a、CD80及CD83抗體，流式細胞儀檢測細胞表面標志分子 CD1a、CD80及 CD83表達均升高，證實為典型DC。將A549細胞用RPMI1640培養基培養，0.25%胰酶消化收集，調整細胞濃度為5×106/ml，置液氮10 min，37℃水浴溶解，反復凍融3次，用超聲波細胞粉碎儀裂解細胞(160 W，持續3 s，間隔5 s，共3 次)，10 000 ×g離心 10 min，取上清，用 0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃保存備用。收集培養第5天DC，將細胞裂解物加入DC，并加TNF-α100 U/ml，培養72 h即得肺癌細胞裂解物負載DC。

1.3 肺癌細胞裂解物負載DC的exosome提取及鑒定 取肺癌細胞裂解物負載DC的上清液，用差速離心法提取exosome。細胞培養上清液1 000×g離心10 min;取上清，10 000×g離心10 min;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100 000×g離心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到100 kD超濾離心管過濾，用0.22μm的濾膜過濾除菌。透射電鏡下觀察exosome形態，呈圓球形，囊泡狀，大小不一，直徑在30～100 nm，即為典型 exosome形態［3］。將 exosome沖擊破膜，取20μg用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，加入鼠抗人HSP70、HLA及CEA抗體，再加入兔抗鼠IgG抗體，ECL反應顯影結果示HSP70、HLA及CEA均呈陽性表達。

1.4 T細胞活化及殺傷率測定 將肺癌細胞裂解物負載DC的exosome(負載組)及未負載DC的exosome(未負載組)各10μg分別加入T細胞混合培養72 h，制成exosome刺激活化的T細胞。將肺癌細胞裂解物負載DC(DC組)與T細胞按1∶10混合培養72 h，制成DC活化的T細胞。以活化T細胞為效應細胞(E)，A549肺癌細胞為靶細胞(T)，按E/T為25∶1、10∶1、5∶1 比例混合培養 96 h，加入 MTT(5 mg/ml)20μl，繼續培養4 h，用酶標儀測波長490 nm的吸光度(A)值。重復實驗3次。計算殺傷率。殺傷率(%)=［靶細胞A值-(反應孔A值-T細胞A值)］/靶細胞A值×100%。

1.5 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件，計數資料比較行χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 exosome相關蛋白表達 蛋白檢測顯示肺癌細胞裂解物負載 DC來源的exosome有HSP70、HLA及CEA表達，而來源于未負載DC的exosome有HSP70及HLA表達，但無CEA表達。

2.2 殺傷率 E/T 為25∶1、10∶1、5∶1 時各組殺傷率均呈降低趨勢，負載組殺傷率分別為65.11% ±6.84%、43.21% ±4.89%、23.19 ±3.25%，未負載組分別為 30.50% ±4.11%、20.33% ±4.16%、10.34%±3.07%，DC 組分別為 50.25% ±4.43%、30.31% ±4.57%、17.34% ±3.20%，相同 E/T 值時負載組殺傷率均明顯高于未負載組(P均＜0.05);E/T為25∶1、10∶1時負載組殺傷率明顯高于DC組，P均＜0.05。

3 討論

exosome最早由Trams于正常細胞和腫瘤細胞培養上清液中發現，后來在研究網織紅細胞成熟為紅細胞階段發現其釋放同樣的小囊泡狀結構，并命名為exosome。研究顯示，exosome可由B淋巴細胞、DC、肥大細胞、腸上皮細胞、腫瘤細胞及血小板等分泌［4，5］，組成復雜，含有與來源細胞功能相關的蛋白質或脂質等成分，由于不同細胞來源的exosome成分不同，因而其功能各異。exosome作為一種新的非細胞性腫瘤疫苗，避免了傳統細胞性瘤苗的不足，可高效呈遞抗原。其組成明確，穩定性高，能夠在-80℃中保存至少2 a，應用于人體不良反應小。

DC為功能強大的專職性抗原呈遞細胞，是機體抗腫瘤免疫反應的啟動者和參與者，將DC的抗原呈遞功能與腫瘤抗原結合是活化T細胞的關鍵。用腫瘤特異性抗原、腫瘤非特異性抗原、腫瘤抗原肽、腫瘤細胞RNA及腫瘤細胞裂解物沖擊DC活化T細胞顯示了不同程度的抗腫瘤作用，其中腫瘤細胞裂解物負載誘導的抗腫瘤效力更強［6，7］。DC分泌的exosome含有豐富的抗原呈遞分子(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、四穿膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、黏附分子(CD11b、CD54)和共刺激分子CD86等免疫分子，可通過暴露MHC分子及共刺激分子直接調節免疫反應，亦可通過轉運內體成分到鄰近細胞而間接調節免疫反應［8］。但由于DC來源的exosome缺乏腫瘤抗原，因而不能有效活化T細胞。經腫瘤抗原負載DC分泌的exosome含腫瘤抗原和抗原呈遞所需物質，可以呈遞抗原，直接刺激活化T細胞，誘導抗腫瘤免疫，其作用機制為:DC質膜表面的MHC分子結合抗原后通過內吞形成多囊體，然后向胞外釋放exosome，這些exosome攜帶了結合抗原的MHC復合物，能被效應細胞捕獲或定向于效應細胞，然后與效應細胞的質膜融合而將抗原提呈給效應細胞，同時exosome上存在的共刺激分子(CD80、CD86)將淋巴細胞活化，發揮特異性抗腫瘤作用［9］。

本研究用腫瘤細胞裂解物負載DC提取exosome顯示有CEA表達，表明exosome含有腫瘤抗原。用exosome刺激活化的T細胞對A549肺癌細胞有明顯殺傷作用，負載組殺傷率明顯高于DC組和未負載組，表明經肺癌細胞裂解物負載DC的exosome能有效誘導抗腫瘤作用。用腫瘤細胞裂解物負載DC制備exosome疫苗，方法簡單方便，效力強，具有良好的應用前景。

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