木蘭花堿對HERG鉀通道蛋白表達的影響

(青海大學醫學院生物化學教研室，西寧 810001)

心律失常為人類猝死的主要原因，其發生、發展與心肌細胞膜上的離子電流改變密切相關，心肌細胞膜上的離子通道為心律失常發生的重要靶點和抗心律失常藥物的作用靶點［1］。HERG(human ether a go-go related gene)編碼心肌快速激活的延遲整流鉀通道(IKr)的α亞基，在心肌細胞的復極化過程中發揮重要作用，既是抗心律失常藥物作用的重要靶點，也是產生致死性心律失常的分子靶點［2］。木蘭花堿(又名木蘭堿，別名唐松草堿)是毛茛科植物粗果唐松草的根街植物中主要的活性物質，具有抗炎、降壓、抑制腫瘤細胞生長及抗心律失常等作用［3，4］，但其對HERG鉀通道蛋白(以下簡稱HERG蛋白)表達的影響鮮見報道。2010年12月～2011年6月，我們觀察了不同濃度木蘭花堿對HERG蛋白表達的影響，旨在探討木蘭花堿抗心律失常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞:HEK-293細胞株(中國協和醫科大學)，穩定轉染 HERG基因重組載體的HEK-293細胞(中國科學院上海生命科學研究所)。藥品與試劑:胎牛血清(上海華壹生物科技有限公司);DMEM培養基(上海滬峰生物科技有限公司，含10% 胎牛血清和400 μmol/L G418);抗HERG的多克隆兔抗體(1∶200，北京博奧森生物技術有限公司);木蘭花堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，實驗前用PBS溶解，過0.22 μm微孔濾膜，無血清培養基稀釋，使終濃度分別為 1、3、10、30 μmol/L;1、3 μmol/L 為低濃度，10、30 μmol/L 為高濃度。

1.2 細胞培養及 HERG蛋白測定 將 HERGHEK-293細胞培養于DMEM培養基中，HEK-293細胞培養于上述不含G418的培養液中，于37℃、5%CO2飽和濕度孵育培養箱培養，消化傳代，取對數生長期細胞采用Western blot蛋白印跡法測定HERG蛋白表達。結果證實HEK-293細胞中沒有HERG蛋白表達;而HERG-HEK-293細胞中存在HERG蛋白表達，共發現兩條帶，一條帶的相對分子質量約為155 kD，另一條帶的相對分子質量在135 kD附近，見圖1A。

1.3 細胞干預及HERG蛋白測定 ①蛋白印跡法:將對數生長期HERG-HEK細胞分別以空白培養基和含木蘭花堿1、3、10、30 μmol/L的培養基中孵育24 h，PBS收集細胞并提取總蛋白，用Bradford法行蛋白定量。測定HERG蛋白表達:取等量樣品，加入等體積上樣緩沖液，煮樣、電泳、轉膜、封閉［5］，加入一抗(1∶2 00)，室溫孵育2 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，用紅外熒光標記的羊抗兔二抗(1∶4 000)避光孵育1 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，再用PBS緩沖液洗膜10 min。用圖像分析軟件Scion Image計算光密度積分值。②免疫熒光法:將對數生長期HERG-HEK細胞稀釋至鋪有蓋玻片的6孔板中培養。待細胞爬片貼壁后，分別以空白培養基和木蘭花堿 1、3、10、30 μmol/L的無血清培養基孵育24 h。依次進行固定、穿透、封閉［5］，一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，用 PBS沖洗 3次，每次 5 min，加入熒光標記的羊抗兔抗體(1∶200)，室溫避光反應2 h。用PBS沖洗3次后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。計量數據以±s表示，采用Students't檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛋白印跡法 低濃度木蘭花堿不影響HERG蛋白的表達(P＞0.05)，高濃度的木蘭花堿顯著抑制 HERG 蛋白，P ＜0.01。1、3、10、30 μmol/L 的木蘭花堿作用后HERG蛋白表達的光密度積分值分別為 1.01、1.03、0.71 和 0.69。高濃度與低濃度比較，P ＜0.01。

2.2 免疫熒光法 顯微鏡觀察發現，低濃度木蘭花堿熒光強度與對照組相比并無明顯變化，隨木蘭花堿濃度升高，細胞膜上的熒光強度逐漸減弱，與蛋白印跡法結果一致。

3 討論

HERG蛋白屬于N連接糖蛋白，研究發現其細胞外部分存在兩個糖基化的位點(N598，N629)，N連接糖基化與HERG通道的穩定性有密切關系，控制蛋白質的折疊、運輸、修飾、以及使其免受蛋白酶的降解［6］。HERG蛋白在轉運至細胞膜前，需要在內質網中合成，經高爾基復合體的修飾加工，在這個過程中，發生錯誤的折疊或裝配不完全的蛋白會在內質網中被質量控制識別并使其潴留在內質網中被降解，其中質量控制機制包括伴侶蛋白控制和蛋白酶降解，均可以影響成熟蛋白的表達。近年來發現，HERG鉀通道在心律失常的發生與治療中起雙重作用，HERG缺陷可引起先天性QT間期延長綜合征(LQTS)，同時某些藥物通過阻斷鈣通道，抑制HERG蛋白表達，可引起獲得性LQTS，甚至引起猝死［7，8］。即HERG鉀通道不僅是抗心律失常藥物作用的一個重要靶點［1］，也是產生致命性心律失常的分子靶位。因此對HERG鉀通道的研究將有助于開發更安全、更高效的抗心律失常藥物。

木蘭花堿屬于雙芐基異喹啉類生物堿，具有良好的抗心律失常作用［2］。但其具體的分子機制及細胞生物學機制并未完全闡明。本研究采用針對N末端的HERG通道蛋白抗體作為一抗，蛋白印跡法發現HERG-HEK-293細胞存在兩條帶，其中相對分子質量為155 kD的蛋白為HERG通道完全糖基化形式，即該通道的成熟形式，主要定位于細胞膜上;而相對分子質量為135 kD的蛋白為HERG通道核心糖基化的形式，即成熟通道的前體，主要存在于內質網和高爾基復合體中［9］。高濃度木蘭花堿作用后HERG蛋白表達明顯受抑。

本研究證實，高濃度木蘭花堿可明顯抑制HERG蛋白表達，此可能為其抗心律失常的分子機制。本研究為木蘭花堿的安全性應用提供了理論支持。

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