結核病的分子生物學診斷技術研究進展

路 超，劉義慶，王長印，盧志明

(山東大學附屬省立醫院，濟南 250021)

近10余年來，結核病發病呈全球持續惡化，2007年死于結核病的患者約177萬［1］。結核桿菌是結核病的主要致病菌，可在人群中傳播，對外界環境的抵抗力強，易產生耐藥菌株。傳統的病原學檢查簡便易行，但特異性、靈敏度較差，血清學等敏感性或特異性不理想。分子生物學診斷技術是一種簡便、快速、靈敏、特異、試劑穩定、無危害性的結核病診斷和分類鑒定方法，現對其研究進展綜述如下。

1 結核桿菌的分子生物學特點

1998年英國Sanger中心和法國的Pasteur研究所合作開展了結核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測序工作［2］，證實結核桿菌全基因組由4 411 529 bp組成，富含許多重復序列，尤其是插入序列，亦包括新的基因家族和管家基因。GC堿基含量高達65.6%，有約3 924個開放閱讀框，其中約40%有功能，44%可能有功能，16%稱為孤獨序列。間隔子是斷裂基因中所具有的非編碼序列，結核分枝桿菌的順向重復序列被非重復的獨特間隔子(長度34～41 bp)分隔。主要的多態串聯重復是結核分枝桿菌染色體中一種主要類型的重復DNA，由10 bp的短串聯重復序列被5 bp的間隔子分隔組成。重組質粒PTBN12包含有一個3.4 kb的插入序列。2001年Fleischmann等［3］對結核桿菌CDC1551全基因組進行測序工作，并與H37Rv株的序列進行比較，得出基因多樣性在結核病發生、發展中扮演重要角色的結論。

2 結核病的分子生物學診斷技術

2.1 核酸擴增技術 PCR技術及其他體外核酸擴增技術在結核病領域的應用，為結核病的診斷和鑒別診斷開辟了新途徑。

2.1.1 單純PCR技術 ①經典的PCR技術。選用一對特異性引物進行擴增，通過檢測擴增后的目的片段來鑒別細菌。此方法一般僅能將細菌鑒別到屬或群，對種的鑒別意義不大。Elbir等［4］報道了一種簡單、快速、敏感的菌落PCR技術，不需抽提結核分枝桿菌的DNA，直接在反應混合物中加入乙醇，可于2 h內有效殺死結核分枝桿菌，其認為該法可簡化診斷步驟，降低操作者潛在感染幾率。②非經典的PCR技術。包括逆轉錄PCR及巢式PCR、半巢式PCR。逆轉錄PCR時一個細胞中rRNA數量是DNA的100倍，因此擴增產物增多，試驗的靈敏度大大提高。該法可用于結核病的診斷，缺點是無法區別死菌和活菌。巢式PCR、半巢式PCR采用內外兩對引物，進行兩次擴增，內引物以外引物擴增產物為模板進行第二次擴增。可提高檢測的靈敏度，亦可從臨床標本中直接檢出結核分枝桿菌，能用于種屬鑒別。單管平衡半巢式PCR可有效控制污染，提高擴增效率;單管巢式逆轉錄PCR可區分死菌與活菌。

2.1.2 在PCR基礎上發展的核酸擴增技術 ①PCR-單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)。是檢測單堿基突變可靠而簡便的方法。PCR產物為兩條互補單鏈，各單鏈的堿基序列不同可形成不同的空間構象，在凝膠上顯示不同的帶型，可確定有無突變。目前采用PCR-SSCP技術分析耐多藥結核桿菌的耐藥機理已成為研究熱點，尤其是該法直接檢測臨床標本中結核桿菌耐藥基因的成功，將會對傳統結核藥敏試驗產生新的挑戰。Sheen等［5］學者檢測比嗪酰胺的耐藥基因，與其他四種技術相比，PCR-SSCP技術快速、高效、價格低廉，對指導臨床治療及用藥有一定應用價值。另有學者用PCRSSCP技術檢測了22株耐多藥的結核藥菌株katG、rpoB、rpsl基因突變，分別檢出突變基因16株、19株、14株，但該法不能確定突變部位和性質，對操作技術要求過高，影響因素較多，目前只在條件較好的實驗室開展研究。②序列特異引物—多聚酶鏈反應(PCR-SSP)。PCR-SSP的引物是根據不同類型核心序列關鍵幾處堿基的差異而設計，產物經電泳分離，呈現為不同的階梯狀擴增片段圖譜。墨西哥學者Méndez等［6］首次用PCR-SSP技術檢測結核病患者KIR基因多態性，簡單、快速。③PCR與核酸探針技術的結合。當靶基因存在時，產生熒光，熒光的強度與PCR產物量呈正比，可定量測定。實時熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特性，可提高目的基因檢測的特異性。Pinsky等［7］用了一種穩定、快速、兩步多重實時PCR技術，在60個臨床樣品中，檢測到3例為卡介苗，57例為結核分枝桿菌，可用于常規臨床實驗室。另有學者介紹了一種寬范圍定量的巢氏Real-Time PCR檢測結核分枝桿菌的方法，具有較高的準確性和較廣的檢測范圍。另外，分子燈塔技術亦適合于檢測點突變。Gomez等［8］為了增加其臨床應用價值，建立了一個客觀的檢測rpoB突變的分子信標qPCR方法，敏感度和特異性均提高。④限制性片段長度多態性及限制性內切酶分析。是以PCR為基礎的分類鑒定技術和限制性內切酶分析相結合的技術。擴增產物經限制性內切酶消化，不同分枝桿菌電泳圖譜呈現多態性。Caws等檢測了耐異煙肼的KatG-315突變基因，與傳統藥敏試驗相比，其敏感性提高到80%，而特異性可達100%。有研究通過對65 kD蛋白基因的PCR產物進行限制性酶切分析，準確檢測出結核桿菌的屬內歸屬。限制性片段長度多態性及限制性內切酶分析法是鑒定分枝桿菌種的可靠程序，較形態學和生理、生化特征等常規方法更準確、快速。⑤PCR-基因缺失分析。分析結核分枝桿菌H37Rv全基因組序列后發現，有16個區域(RD1-RD16)在結核分枝桿菌成員中缺失存在差異。因此，應用PCR技術探查基因組特異的區域是否存在，通過特定的缺失圖譜可區別各成員。Pounder等［9］應用PCR基因缺失—解鏈溫度分析結核分枝桿菌的不同成員，準確率為94%。該方法最突出的優點是可簡單快速地鑒別MTC成員。⑥隨機擴增多態性DNA。原理是用一條人工合成寡核苷酸引物對整個DNA鏈進行探查，在較低溫度下與匹配或部分匹配的退火位點結合，擴增出呈現多態的DNA片段，經電泳后可得到DNA指紋圖譜，從而進行菌種鑒定。Esteban等檢測鑒定了戈登分支桿菌，此方法對標本要求不高，簡單快速，成本較低，且又無需預知靶DNA序列。⑦逆轉錄—環介導等溫擴增—酶聯免疫法(RT-LAMP-ELISA-hybridization)。由 Lee 等［10］發明的一種新技術，用于快速檢測結核分枝桿菌的16S rRNA，檢測靈敏度為94.1%，高效、低價，有望用于常規臨床檢測。⑧異源雙鏈分析。是將含有突變基因和同段無突變基因PCR擴增產物混合，加熱變性后再復性，若待測基因有突變，則在復性過程中可形成部分來源于突變與無突變基因的異源雙鏈，同時亦形成部分同源雙鏈。根據電泳遷移率的差別判斷有無基因突變。

2.2 DNA探針技術 核酸探針是指用放射性或非放射性物質標記已知DNA或RNA片段，檢測樣品中未知的核苷酸序列，經顯影、顯色或熒光檢測的方法，將結合核苷酸的位置或大小顯示出來。迄今為止，用于結核桿菌快速檢測和鑒定的探針有cDNA探針、全染色體核酸探針、寡核苷酸探針、克隆核酸探針和DNA片段探針等，檢測方法有膜斑點雜交、原位雜交、印跡雜交和液相雜交等。核酸探針技術的顯著特點是高度特異性，可用于結核病的診斷、菌種鑒定和耐藥性檢測等方面，使用最廣泛的是反向斑點雜交技術及反向線點雜交技術。有學者鑒定了15種臨床上常見的分枝桿菌，與傳統的生化試驗和測序相比敏感性和特異性均為100%。基因芯片基于反向雜交技術，將大量靶基因探針高密度排列固定于一塊特殊處理的載體上，標記的PCR產物與載體上的探針進行雜交，以特定儀器檢測雜交信號而對細菌進行鑒定。Sanguinetti等［11］用此技術進行檢測，需樣本少、準確、信噪比極小且易于操作，開辟了新的臨床診斷視野。由于芯片制備較復雜，檢測成本高，臨床實驗室很難推廣使用。WHO推出了一種線性探針檢測法，由德國一家企業開發，可直接用患者的唾液來判斷其中的結核菌是否對兩種常用藥物具有抗藥性，便于醫生快速做出診斷。

2.3 指紋圖譜技術 在結核分枝桿菌染色體DNA中選擇合適的重復序列作為遺傳標志，建立DNA指紋圖譜技術，可檢測出流行病學上無關菌株的DNA多態性。用限制性內切酶消化結核分枝桿菌染色體DNA上特定的核苷酸序列，電泳分離后，將片段轉移至膜上，與帶標記的DNA探針雜交，檢測出與探針同源的限制性片段，其片段的數目和大小的變化使每株分離株呈特征性帶型。PCR雙脫氧指紋圖譜是由PCR-SSCP和雙脫氧DNA測序結合產生的一種方法，主要用于結核菌耐藥型測定。

2.4 DNA測序技術 包括雙脫氧鏈終止法、化學降解法、PCR測序法及DNA測序儀的應用。焦磷酸測序法準確性更優于傳統測定法，是檢測分枝桿菌特異性核苷酸序列最直接可靠的方法，已成為菌種鑒定的“金標準”。Bao等［12］學者對焦磷酸測序法及常規分型法、SANGER法進行比較發現，焦磷酸測序法鑒別抗酸桿菌的準確率為98%。目前，DNA序列測定不僅可鑒別應用生化試驗難以鑒別的菌種，而且可鑒定某些少見的或需特殊營養成分的分支桿菌菌種，不僅能用于基因突變的檢測，且能確定突變的性質與部位。Che等［13］用序列分析法檢測了與結核相關的IRGM基因多態性，結果在其啟動子區域發現29個多態性位點。

2.5 高效液相色譜技術 根據離子對反相高效液相色譜技術的原理，通過DNA分離柱，對核酸片段進行分離和分析。一些學者采用此技術對抗結核藥物耐藥性相關基因突變進行篩選的結果再次肯定高效液相色譜技術用于分枝桿菌鑒定的可行性。通過研究耐藥基因的突變點，結合序列分析，成為簡單高效快速的檢測結核病耐藥基因較實用的方法。變性高效液相色譜技術是一種新的基因檢測技術，在分枝桿菌基因分型鑒定及耐藥基因檢測方面均有較大應用價值。

隨著分子生物學技術和交叉學科的發展，目前臨床實用而頗具開發價值的反向雜交技術已顯示出極大優勢，適合在地區級分枝桿菌實驗室開展。DNA測序是公認的鑒定菌種和檢測耐藥基因突變的“金標準”，隨著測序儀不斷改進，其應用可望普及。此外，液相芯片技術亦具有良好應用前景。結核病分子生物學的研究在不同領域已取得較大進展，隨著各種技術不斷完善與發展，分子生物學將為結核病的診斷、治療、流行病學調查等提供更大幫助。

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