參麥注射液對(duì)裸鼠皮下移植瘤抗血管生成作用的機(jī)理探討

馬亞軍，錢曉萍，周榮平，張有成

(1南京市江寧醫(yī)院，南京211100;2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院)

參麥注射液(SM)由人參、麥冬提取物混合組成，具有益氣養(yǎng)陰的功效。研究表明［1］，SM在體外和荷瘤小鼠體內(nèi)有明顯的抗腫瘤血管生成作用。2005～2006年，我們制作了裸鼠荷人LOVO細(xì)胞大腸癌模型，旨在探討SM對(duì)裸鼠人大腸癌移植瘤血管生長的抑制作用及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料及動(dòng)物 SM為正大青春寶藥業(yè)公司產(chǎn)品。人大腸癌LOVO細(xì)胞由南京市鼓樓醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。4～6周BALB/c-nu小鼠(SPF級(jí))10只，均為雌性，重量16～18 g，購自上海斯萊克公司。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)小鼠抗人一抗、CD34小鼠抗人一抗購自Neo Markers公司，凝血酶敏感蛋白1(TSP1)小鼠抗人一抗、抗小鼠二抗工作液購自Novocastra公司。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠腫瘤模型制作 在37℃、5%CO2孵箱環(huán)境下，將人大腸癌LOVO細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用生理鹽水將其制成濃度1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取0.2 ml接種于裸鼠腋窩皮下。成功建立裸鼠腫瘤模型后，將小鼠隨機(jī)分為兩組各5只，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.4 ml/d，SM組腹腔注射SM 20 ml/(kg·d)，均連續(xù)2周。

1.2.2 VEGF、TSP1檢測 2周時(shí)，采用脫頸椎法處死兩組小鼠，完整剝?nèi)∧[瘤。用10%甲醛固定24 h，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色。采用免疫組化染色法檢測微腫瘤血管密度(MVD)、VEGF及TSP1。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) ①腫瘤質(zhì)量抑制率:從給藥第1天起，每2 d測量腫瘤長徑、短徑，計(jì)算腫瘤體積。停藥后處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，稱取腫瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤質(zhì)量抑制率。②MVD:采用Weidner判斷標(biāo)準(zhǔn)。VEGF、TSP1在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及胞質(zhì)中均呈棕黃色。先用低倍鏡判斷整個(gè)切片的染色強(qiáng)度，然后在高倍鏡下選擇3個(gè)微血管密集區(qū);染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率相加為每個(gè)區(qū)域得分，兩者之和0分為陰性，1～4分為弱陽性，＞4分為強(qiáng)陽性。染色強(qiáng)度記分:0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強(qiáng)陽;陽性細(xì)胞率記分:陽性細(xì)胞 ＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤體生長情況 用藥第1、7、13天，對(duì)照組腫瘤體積分別為(898.5 ±252.0)、(1 521.5 ±560.5)、(3 496.4 ±976.2)mm3，SM 組分別為(583.8 ±124.5)、(868.5 ±181.1)、(1 698.2 ±532.0)mm3，兩組腫瘤體積比較P＜0.05。用藥后，對(duì)照組腫瘤負(fù)荷較重，表現(xiàn)為形體消瘦、皮色差、行動(dòng)遲緩;SM組腫瘤負(fù)荷較輕，表現(xiàn)為皮毛光亮、行動(dòng)正常。

2.2 腫瘤質(zhì)量抑制率 對(duì)照組腫瘤質(zhì)量為(2.90±0.65)g，SM 組為(1.48 ±0.66)g，兩組比較 P ＜0.01。SM組腫瘤質(zhì)量抑制率為49%。

2.3 兩組 MVD比較 對(duì)照組 MVD為(48.7±18.8)%，SM 組為(20.0 ±4.4)%，兩組比較 P ＜0.01。

2.4 兩組 VEGF比較 對(duì)照組 VEGF為(5.2±0.3)分，VEGF 表達(dá)強(qiáng)陽性;SM 組分別為(3.8 ±0.3)分、VEGF表達(dá)弱陽性。兩組比較P均＜0.01。

2.5 兩組 TSP1比較 對(duì)照組、SM組 TSP1均為(0.2±0.3)分，其TSP1定性均為陰性;兩組比較 P均 ＞0.05。

3 討論

腫瘤血管生成與實(shí)體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制實(shí)體腫瘤血管生成，阻斷腫瘤營養(yǎng)供應(yīng)，是腫瘤抗血管生成治療的主要理論基礎(chǔ)。目前認(rèn)為，腫瘤血管生成過程中存在內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移和基底膜降解等環(huán)節(jié)，腫瘤血管生成促進(jìn)因子和抑制因子調(diào)控著腫瘤血管生成的進(jìn)程;當(dāng)血管生成促進(jìn)因子升高或其抑制因子降低時(shí)，可促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移;反之則抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

MVD是反映惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后與腫瘤MVD密切相關(guān)。Tse等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織或有惡變趨勢(shì)組織中MVD升高，正常組織或良性腫瘤組織中MVD降低。本研究顯示，SM 20 ml/kg可明顯抑制人大腸癌LOVO細(xì)胞移植瘤生長，明顯降低小鼠腫瘤組織的MVD，抑制其血管生成，說明抗血管生成是SM抗腫瘤的重要機(jī)理之一。

VEGF是一種具有肝素活性的生長因子、高效的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，能特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，對(duì)血管生成有極強(qiáng)的誘導(dǎo)作用［3］。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤組織 VEGF強(qiáng)表達(dá)與 MVD呈正相關(guān)［4］。TSP1是分子量為450 kD的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，由多種細(xì)胞合成，并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮生理作用。1990年，Good等［5］首先發(fā)現(xiàn)TSP1有抗血管生成活性。Yee等研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展性腫瘤早期TSP1可發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。本研究顯示，SM 20 ml/kg可明顯下調(diào)腫瘤組織的VEGF表達(dá)，對(duì)TSP1無調(diào)節(jié)作用;說明SM的抗血管生成機(jī)理可能與其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血管生成，下調(diào)VEGF表達(dá)、間接干擾腫瘤血管生成有關(guān)。

總之，本研究證明，SM可抑制小鼠的腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用，為SM的抗腫瘤治療開辟了新思路。

［1］尹麗慧，高承賢，丁志山，等.參麥注射液對(duì)血管生成影響的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，10(22):761-763.

［2］Tse GM，Ma TK，Chan KF，et al.Increased microvessel density in malignant and borderline mammary phyllodes tumors［J］.Histopathology，2001，38(6):567-570.

［3］Longo R，Gasparin G.Challenges for patient selection with VEGF inhibitors［J］.Cancer Chem Pharm，2007，60(2):151-170.

［4］Seo Y，Baba H，F(xiàn)ukuda T，et al.High expression of vascular endothelial growth factor is associated with liver metastasis and a poor prognosis with ductal pancreatic adenocarcinoma［J］.Cancer，2000，88(10):2239-2245.

［5］Good DJ，Polverini PJ，Rastinejad F，et al.A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(17):6624-6628.