干細胞移植治療甲狀腺功能減退癥的研究進展

陳麗紅，楊凌輝

(1青島大學醫學院，山東青島266021;2中國人民解放軍第401醫院)

目前，甲狀腺功能減退癥(甲減)的主要治療方法是甲狀腺激素替代治療、異體或異位成體甲狀腺移植、胎兒甲狀腺供體移植和甲狀腺細胞替代治療等，但均有局限性。近年研究發現，胚胎干細胞(ESCs)經胚胎體發育階段，在特定條件下可定向分化為甲狀腺細胞［1］，為ESCs源性甲狀腺細胞替代治療甲減提供依據。現結合文獻就干細胞(SC)移植治療甲減的研究進展綜述如下。

1 SC及SC分化

SC是一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，能產生表型與基因型完全相同的子細胞，是機體其他細胞的起源［2］。根據其分化潛能分為4類:①全能干細胞:具有自我更新并能分化為任何類型組織細胞的能力，如受精卵和ESCs。②多能干細胞:屬分化方向確定的SC，如神經干細胞、造血干細胞等。③定向祖細胞:是多能干細胞分化的下游細胞，其分化和自我維持、自我更新能力受限，如造血祖細胞。④專能干細胞:只能向某一類型的細胞分化，如神經前體細胞。但是如何誘導SC分化為期待的組織或細胞，是目前SC研究領域的重要環節。ESCs是從著床前囊內細胞團或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖細胞分化出來的全能干細胞，是胚胎發育的基礎，具有無限增殖、自我更新和多向分化能力。在有飼養層或抑制因子存在的條件下，ESCs能保持未分化狀態，一旦去除這些分化抑制因素或添加某些誘導分化因子，就可向某些細胞分化。目前，關于甲狀腺SC的誘導分化主要集中在ESCs。

2 ESCs體外誘導分化為甲狀腺細胞

甲狀腺SC移植的關鍵是將ESCs定向誘導為甲狀腺細胞。以前獲得甲狀腺細胞的方法是依賴體外培養人或鼠的甲狀腺細胞系—FRTL-5細胞株［3］。因其培養物中經常混雜其他類型的細胞，導致培養純度降低，故不能作為較純的甲狀腺細胞來源。隨著ESCs誘導造血細胞、神經及心肌細胞等成功，Lin等［4］開始了ESCs定向誘導分化成甲狀腺細胞的研究。

2.1 ESCs體外誘導分化的方法 在體外，ESCs因某些分化抑制因子存在，如成纖維滋養層細胞分泌的分化抑制因子等，不能自動定向分化［5］，保持未分化狀態;而維甲酸、二甲基亞砜、六亞甲基乙酰胺及神經生長因子等則可定向誘導ESCs分化。Lin等將ESCs置于DMEM培養基中，并采用15%胎牛血清培養，用1%白血病抑制因子抑制其分化;得到擬胚體(EB)后，用15%胎牛血清、0.5 mg/ml抗壞血酸及1.5×10－4mol/L硫代甘油培養，最終隨著 EB成簇生長，ESCs也不斷生長，證明ESCs在某些誘導因子作用下能定向分化。因各誘導因子只能誘導唯一的細胞類型，且其誘導機制尚不清楚，故在誘導ESCs分化時帶有一定的盲目性。

2.2 ESCs體外誘導分化為甲狀腺細胞的研究現狀 Lin等［6］將野生小鼠胚胎干細胞CCE株誘導分化為甲狀腺細胞樣細胞時，發現ESCs發育6 d的EB在基因表達上與正常甲狀腺濾泡細胞均可檢測到成對框基因8、Na+/I－同向轉運體(NIS)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶和促甲狀腺激素(TSH)受體，表明該胚體具有甲狀腺功能。為提高ESCs分化期間產生甲狀腺細胞的比例，通過研究產生了一種TSH受體啟動子［7］，在其控制下，可追蹤攜帶增強型綠色熒光蛋白(GFP)—新霉素雙抗ESCs在體外分化期間甲狀腺細胞產生的GFP表達。GEP陽性細胞是依賴于ESCs的衍生胚體，如果前2～4 d分化期間使用促甲狀腺激素處理，則GFP陽性細胞比例明顯增加。這些由ESCs衍生的GEP陽性細胞輔以TSH的無血清環境基質膠中，形成甲狀腺濾泡樣細胞群［8］。免疫熒光研究證實，在細胞群中有共區域化帶有NIS的TSH受體，且NIS在質膜中可專門表達。此外，在這些細胞中可觀察到I－攝取活動。此標志著由ESCs分化為甲狀腺濾泡細胞成功。

因不同物種的ESCs在某些細節上分化不同，故其用于人類ESCs尚需驗證。人類ESCs分化形成內胚葉，類似于脊椎動物在體內原腸胚形成期間發生的內胚葉分化。隨后，這些人類內胚葉細胞可在一定條件下分化為更成熟的內胚層器官細胞［9］。因甲狀腺濾泡細胞產生于脊椎動物生長期間的內胚葉細胞中，故采用類似方法可能用來刺激人類ESCs分化形成甲狀腺濾泡細胞。雖然確切的必要培養條件尚未確定，但這些研究無疑幫助我們發現甲狀腺細胞分化的機制。

2.3 人體甲狀腺中存在成人SC的證據 目前發現，成人SC存在于人的骨髓、肝臟、胰臟和腦組織中。Thomas等［10］研究SC Oct-4表達和人類甲狀腺中最初單獨培養的內胚層GATA-4、HNF-4時發現，在某些甲狀腺癌細胞中可檢測到Oct-4表達，而非GATA-4表達，說明人類甲狀腺中存在成人SC和內胚層前體細胞。這些研究將為評估甲狀腺SC是否可能有效地治療甲減提供參考依據。

3 LSC再生治療的臨床應用價值

ESCs本身有很強的自我更新和定向分化能力，其不但對研究甲狀腺細胞的分化提供了研究模型，而且為甲狀腺基因振作與分析提供了大量細胞來源。通過EB中的甲狀腺多能干細胞研究，最終使我們更好地理解甲減等疾病，同時ESCs作為甲狀腺濾泡細胞的更新來源，使甲狀腺替代治療成為可能。如果使用細胞替代療法進行移植治療，必須滿足以下條件:第一，胚胎或成人SC的前體細胞必須確定能夠在體外擴增到大批成熟，以替代甲狀腺細胞;第二，這些替代細胞必須能夠合成甲狀腺球蛋白，具有運輸碘、碘化物和甲狀腺球蛋白的能力，并且能在生理上以適當的方式儲存和釋放甲狀腺激素;第三，必須能夠嚴格控制細胞增殖的能力，以避免移植細胞后發展為甲狀腺功能亢進癥。

4 問題和展望

最近SC的研究有兩個重大的技術突破，一是人類ESCs在體外培養成功;二是成體SC橫向分化。這表明成體SC在一定微環境作用下，可橫向分化為需要的細胞和組織，起到有效的治療作用。目前，將ESCs定向誘導分化成甲狀腺細胞的研究較少，今后可使用懸浮法將ESCs誘導分化成EB，在合適的培養條件下，通過EB定向分化成甲狀腺細胞，通過EB中的甲狀腺多能干細胞對甲狀腺的發生、發育進行詳細的分子水平研究，最終了解甲減等疾病的發病機理。同時，可將ESCs作為載體細胞，利用ESCs的可塑性將其與自身甲狀腺結合，將不同的基因信號導入ESCs中，使其在抑制部位表達，為細胞替代治療結合基因治療開創可觀的前景。

總之，目前對ESCs的研究尚存在倫理學方面的爭議，以及其自身特征不確定等問題，且實驗結果能否用于人體尚存爭議。因此，積極探索成體SC的定向誘導作為甲狀腺濾泡細胞的更新來源具有重要意義。

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