食用白酒對實驗性肝纖維化TGF-β1的影響

劉春光 （公安縣人民醫院消化內科，湖北 公安434300）

盧 平 （長江大學荊州臨床醫學院 荊州市中心醫院消化內科，湖北 荊州434020）

肝纖維化是各種慢性肝損傷共有的組織變化，和肝硬化是連續的發展過程，為可逆性病變，其中心環節是肝星狀細胞 （HSC）激活并轉化成肌成纖維細胞樣細胞 （MFB）、細胞外基質 （ECM）過度合成和基質降解能力下降。轉化生長因子-β1（TGF-β1）為現知最強力的肝纖維化促進因子，是激活HSC并促進其表達ECM的關鍵因子。國內有學者報道了貴州茅臺酒能延緩肝纖維化的發展［1］，引起了關注。我們通過觀察茅臺酒對實驗性肝纖維化TGF-β1信號轉導的影響，來探討茅臺酒對肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 雄性 Wistar大鼠79只，體質量230～270g，常規條件下飼養 ，溫度 （22±2）℃，濕度 （55±5）%，人工照明1h，自由取水取食，飼料由公司提供，飲用水為自來水飼養。

1．1．2 試劑 53% （V／V）貴州茅臺酒 （批號：6845169830，驗證碼：5212635463568104），無水乙醇 （分析醇），四氯化碳 （CCL4）分析純，蓖麻油分析純，0．9%氯化鈉溶液。

1．2 方法

1．2．1 動物模型的制備 按照隨機數字表隨機分成6組。①正常對照組 （n＝9）：0．9%氯化鈉溶液灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；②茅臺酒 CCL4組 （n＝12）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射（0．2ml／100g，2次／周，首劑加倍。下同），同時給予53% （V／V）貴州茅臺酒灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；③乙醇CCL4組 （n＝13）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射同時，給予53% （V／V）乙醇灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；④茅臺酒組 （n＝14）：53% （V／V）貴州茅臺酒灌胃；⑤乙醇組 （n＝16）：53% （V／V）乙醇灌胃；⑥CCL4造模組 （n＝15）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射，同時生理鹽水灌胃。

1．2．2 觀測指標及方法 實驗第2周，CCL4造模組、乙醇CCL4組分別死亡1只。實驗第4周和第8周末分批處死動物40、37只，取血和肝臟。血清標本在-20℃保存待測，同時取肝臟組織，記大體情況，取部分肝臟固定于4%多聚甲醛內，常規石蠟包埋，2μm連續切片。①血清肝功能檢測：采用全自動生化儀測定ALT、AST、ALB血清濃度的改變；②血清肝纖維化檢測：放射免疫法檢測層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原 （PCⅢ）血清濃度的改變；③免疫組織化學法檢測TGF-β1：采用SABC法，用DAB顯色，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作；一抗濃度均為1∶150，陰性對照用PBS代替一抗。結果判定：陽性染色者在細胞漿或／和細胞膜呈棕色顆粒沉著。隨機取5個高倍視野計數陽性細胞，小于5% （-），6%～25% （＋），26%～50% （＋＋），51%以上為 （＋＋＋）。④病理形態學觀察：HE染色，由同一病理專科醫師光鏡下做肝纖維化病理學分級［2］：0級，無纖維化；Ⅰ級，匯管區擴大，纖維化；Ⅱ級，匯管區周圍纖維化或纖維間隔形成，小葉結構保留；Ⅲ級，纖維間隔大量形成伴小葉結構混亂，無肝硬化；Ⅳ級，肝硬化。

1．3 統計學分析

實驗結果以±s表示，采用SPSS統計軟件包（11．5版）進行統計學分析，計量資料用t檢驗；計數資料采用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 各組大鼠血清肝功能變化

同正常對照組相比，各造模組ALT、AST水平明顯升高 （P＜0．05），茅臺酒組和乙醇組ALB有一個先升高后降低的過程，茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組ALB水平持續降低。同正常對照組相比，茅臺酒組的ALT、AST在第4周末無統計學差異性 （P＞0．05），兩組ALB差異有統計學意義（P＜0．05），到第8周末時ALT有統計學差異 （P＜0．05），ALB差異無統計學意義 （P＞0．05）；乙醇組ALT、AST在第4周末、第8周末有統計學差異 （P＜0．05），ALB差異無統計學意義 （P＞0．05）。同CCL4組相比，乙醇CCL4組在第4周末、第8周末對肝功能的影響差異無統計學意義 （P＞0．05），在第8周末茅臺酒CCL4組ALB有統計學差異 （P＜0．05）。在第4周末，茅臺酒和乙醇組比較，ALT、ALB有統計學差異 （P＜0．05），AST差異無統計學意義 （P＞0．05），到第8周末，ALT仍有統計學差異 （P＜0．05），ALB差異無統計學意義 （P＞0．05）。在第4周末、第8周末茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組肝臟功能差異無統計學意義 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組ALT、AST差異無統計學意義 （P＞0．05），ALB有統計學差異 （P＜0．05）。見表1。

2．2 對血清LN、PCⅢ的影響

各個造模組的LN、PCⅢ均升高，茅臺酒組升高不明顯，其他各組明顯升高 （P＜0．05）。在第4周末，茅臺酒組和乙醇組、乙醇CCL4組和茅臺酒CCL4組的LN之間有統計學差異 （P＜0．05），但是PCⅢ差異無統計學意義 （P＞0．05）。在第4周末，同CCL4組比較，乙醇組PCⅢ有統計學差異（P＜0．05），LN則差異無統計學意義 （P＞0．05），乙醇CCL4組LN、PCⅢ無統計學意義 （P＞0．05）。在第8周末，同CCL4組相比，乙醇組、茅臺酒CCL4組PCⅢ有統計學差異 （P＜0．05），LN無統計學意義 （P＞0．05），茅臺酒組LN、PCⅢ有統計學差異 （P＜0．05）。在第4周末、第8周末，同對照組比較，乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組LN、PCⅢ有有統計學差異 （P＜0．05），茅臺酒組LN、PCⅢ無統計學意義 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組LN、PCⅢ無差異性。見表2。

在第4周末、第8周末，同組大鼠血清肝功能和纖維化指標的比較見表3。

2．3 各組大鼠肝纖維化病理學表現

正常對照組肝小葉內網狀纖維支架完整，分布規則，無膠原纖維存在。四氯化碳造模組、茅臺酒四氯化碳組、乙醇四氯化碳組第4周末出現纖維間隔，肝臟細胞大量空泡變性，脂肪變性，部分小葉結構混亂。到第8周末，大量老鼠肝臟組織內假小葉形成，部分出現肝臟硬化。茅臺酒組只有部分出現肝纖維化，罕見纖維間隔。在第4周末、第8周末：同對照組相比，茅臺酒對纖維化的病理學分級無統計學意義 （P＞0．05），乙醇組則有統計學差異 （P＜0．05）；同CCL4組相比，茅臺酒組、乙醇組有統計學意義 （P＜0．05），茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組無統計學差異 （P＞0．05）；茅臺酒組和乙醇組之間病理學分級有統計學意義 （P＜0．05），茅臺酒CCL4組和乙醇CCL4組之間沒有統計學差異 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組病理學分級無統計學意義 （P＞0．05），乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組有統計學意義 （P＜0．05）。見表4。

表1 各組Wistar大鼠血清肝功能結果

表2 各組大鼠血清LN、PCⅢ的變化

表3 各組Wistar大鼠血清肝功能和纖維化指標在第4周末、第8周末的比較

表4 各組Wistar大鼠肝纖維化病理學分級 例

2．4 對TGF-β1 表達的影響

TGF-β1在正常肝臟門靜脈周圍細胞及小葉中央靜脈周圍細胞和匯管區的結締組織偶見表達，著色較淡。隨著肝纖維化程度的逐步加重，其陽性表達越來越明顯，在匯管區周圍非實質細胞、竇壁細胞、纖維間隔、竇周細胞、中央靜脈周圍細胞及部分肝臟細胞均見陽性表達。在第4周末、第8周末，茅臺酒組和乙醇組之間TGF-β1陽性表達有統計學意義 （P＜0．05）。茅臺酒CCL4組和乙醇CCL4組之間無統計學差異P＞0．05）。同對照組相比，乙醇組TGF-β1陽性表達有統計學差異 （P＜0．05），茅臺酒組差異無統計學意義 （P＞0．05）。同CCL4組相比，茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組TGF-β1陽性表達差異無統計學意義（P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組TGF-β1陽性表達無統計學意義 （P＞0．05），乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組TGF-β1陽性表達有統計學意義 （P＜0．05）。見表5。

表5 各組大鼠TGF-β1表達的變化 例

3 討 論

肝纖維化是各種慢性肝損傷共有的組織變化，病理特點為匯管區和肝小葉內ECM過度沉積。其中心環節是HSC激活并轉化成MFB、ECM過度合成和基質降解能力下降。TGF-β1能促進HSC合成膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外基質，并抑制間質金屬蛋白酶 （MMPs）合成，促進HSC分泌金屬蛋白酶組織抑制物 （TIMPs）等而減少ECM的降解［3］。

現有研究證明阻斷TGF-β1信號通路可明顯阻斷肝纖維化進展［4］。TGF-β1信號分子通過跨膜的受體復合物進行信號轉導。本實驗研究表明，茅臺酒對LN、PC的影響不明顯，乙醇卻有明顯的影響。同CCL4組相比，茅臺酒CCL4組在第8周末對ALB、PCⅢ的影響顯示出統計學差異，乙醇CCL4組無統計學變化，提示同乙醇相比，茅臺酒可以延緩四氯化碳造成的纖維化損傷。

在本研究中，茅臺酒組對TGF-β1表達的影響和乙醇組間有統計學差異。TGF-β1是激活HSC的關鍵因子。在茅臺酒的影響下，其陽性表達降低，會對肝纖維化的發展有一定的抑制作用。

茅臺酒是知名國酒，其含有一定量蛋白質，18種氨基酸，多種維生素和微量元素，富含超氧化物歧化酶，甲醇、苯和醛類化合物的含量遠低于國際標準。并有初步的研究表明茅臺酒可以誘導肝臟金屬硫蛋白含量增加［1］。在我們的研究中，茅臺酒組對肝臟有一定的損傷，但茅臺酒沒有顯著增加TGF-β1的表達，可通過影響TGF-β信號轉導對肝纖維化有一定的抑制作用。

［1］程明亮，吳君，張文勝，等 ．茅臺酒對肝臟的作用及其影響的實驗研究 ［J］．中華醫學雜志，2003，83（2）：237-241．

［2］Hayasaka A，Saisho H．Serum markers as tools to monitor liver fibrosis ［J］ ．Digestion，1998，59：381-384．

［3］Gressner A M．Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis ［J］．Front Biosci，2002，7：793-807．

［4］汪玲，胡國齡，譚德明 ．TGF-β1Ⅱ型受體部分基因表達質粒對實驗性大鼠肝纖維化的影響 ［J］．中華傳染病雜志，2002，20（3）：168-171．