多波長高效液相色譜法同時測定抗菌消炎膠囊中3種有效成分的含量

黃 銘 黃冬梅 彭莉云

1.廣西壯族自治區柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545001;2.廣西中醫學院賽恩斯新醫藥學院，廣西 南寧 530001

抗菌消炎膠囊為收載于部頒藥品標準第七冊［1］的抗菌消炎片改變劑型品種，由金銀花、百部、黃芩、大黃、大青葉、知母、金錢草等7味中藥組成，具有清熱、瀉火、解毒的功效。

原片劑標準未對組方中任何有效成分進行定性、定量監控，在《中國藥典》(2010年版)中并未收入有關抗菌消炎膠囊含量測定的方法和標準。方中金銀花清熱解毒，涼散風熱，其有效成分為綠原酸;黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血，其有效成分為黃芩苷、黃芩素;大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、活血祛瘀，其有效成分為大黃酚、大黃素、大黃酸等。該制劑已有一些文獻對抗菌消炎片的藥效學、薄層色譜、某些成分含量測定方面作了研究報道［2－10］。本實驗采用多波長高效液相色譜 (HPLC)法同時測定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷和大黃酚的含量，以控制本品的內在質量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent LC－1100高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、1260二極管陣列檢測器。色譜柱為VPODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm)，島津AE200電子分析天平。

1.2 試藥 對照品綠原酸 (0753－200111)、黃芩苷(110715－200514)和大黃酚 (0796－200005)均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純、磷酸為分析純，水為一級純化水。

抗菌消炎膠囊為廣西柳州某藥廠提供，陰性樣品按抗菌消炎膠囊處方比例配置。

2 方法和結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品綠原酸、黃芩苷和大黃酚適量，精密稱定，置同一20ml量瓶，用70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對照品備用溶液。精密吸取上述混合對照品備用溶液，稀釋成濃度分別為綠原酸10.58μg/ml、 21.16μg/ml、 42.32μg/ml、 105.8μg/ml 、211.6μg/ml 、 317.4μg/ml ; 黃 芩 苷 15.77μg/ml、31.54μg/ml、 63.08μg/ml、 157.7μg/ml、 315.4μg/ml、473.1μg/ml;大黃酚 0.5043μg/ml、1.009μg/ml、2.017μg/ml、5.043μg/ml、10.09μg/ml、15.13μg/ml的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取抗菌消炎片20片，去除包衣用研缽碾成細粉，精密稱取上述粉末0.30g，置50ml具塞錐形瓶中，稱定重量，加70%甲醇20ml超聲處理30min，靜置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱:VP－ODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm);流動相:A相為0.1%磷酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫 (0～20min:85% →55%A，15% →45%B;20～40min:55%A，45%B;41～42min:55%→85%A，45%→15%A);流速:1.0ml/min;檢測波長:280nm(0～20mim，檢測綠原酸)、372nm(20～30nim，檢測黃芩苷)、254nm(30～40nim，檢測黃芩苷);柱溫:30℃;進樣量為 10μl。

2.4 系統適應性 陰性樣品在綠原酸、黃芩苷和大黃酚的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好，且在40min內基線分離且空白無干擾。空白、對照品以及樣品的色譜圖見圖1。

2.5 線性關系考察 分別將配置的系列對照品溶液依次進樣，以對照品溶液的濃度 (X，μg/ml)對峰面積 (Y)進行線性回歸。綠原酸、黃芩苷和大黃酚的回歸方程分別為:Y=10.35X－5.354，r=0.9999;Y=9.753X－1.768，r=0.9988;Y=13.43X－2.876，r=0.9996。線性范圍:綠原酸10.58 ～317.4μg/ml，黃芩苷15.77 ～473.1μg/ml，大黃酚0.5043 ～15.13μg/ml。

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μl，重復進樣5次，測定峰面積RSD(n=5)結果分別為:綠原酸0.65%，黃芩苷0.48%，大黃酚0.77%。表明該方法的精密度良好。

2.7 檢測限 將綠原酸、黃芩苷、大黃酚對照品溶液分別進行稀釋，以信噪比為3∶1時，確定其最低檢測限分別為0.321μg/ml、0.210μg/ml、0.044μg/ml。

2.8 穩定性試驗 取制備的供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、16、24h測定綠原酸、黃芩苷、大黃酚的峰面積，計算峰面積的RSD分別為1.0%、1.3%、1.9%，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.9 重復性試驗 精密稱取同一批供試品5份，分別按供試品測試條件測定綠原酸、黃芩苷、大黃酚的峰面積，計算峰面積的RSD為0.73%;黃芩苷RSD為0.87%;大黃酚RSD為1.80%;結果表明本方法的重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的供試品0.15g共9份，按低、中、高濃度分別精密加入綠原酸、黃芩苷、大黃酚對照品溶液一定的量 (樣品含量的80%、100%、120%)，每一濃度平行制備3份，照供試品測定項下操作，測定峰面積，計算回收率，結果綠原酸、黃芩苷、大黃酚的回收率分別為:99.5%(RSD=0.8%，n=3);98.9%(RSD=1.1%，n=3);98.3%(RSD=1.8%，n=3)。結果表明，采用本方法測定抗菌消炎膠囊中綠原酸、黃芩苷、大黃酚的含量，加樣回收率良好。

2.11 樣品測定 照供試品測定項下操作制備供試品溶液3份，測定峰面積，將所得的峰面積代入標準曲線，計算綠原酸、黃芩苷、大黃酚的平均含量，分別為8.30mg/g(RSD=0.45%)、20.33mg/g(RSD=0.78%)、0.11mg/g(RSD=1.9%)。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇取對照品溶液，在200nm～400nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，結果在280nm波長處黃芩苷有最大吸收，372nm波長處綠原酸有最大吸收，254nm波長處大黃酚有最大吸收。在實驗中曾選擇280nm波長下同時檢測3個成分，結果發現降低了綠原酸和大黃酚的檢測靈敏度。故采用多波長分別在各個被測成分紫外最大吸收波長處同時進行含量檢測。即提高了檢測靈敏度，又保障測定結果準確可靠。

3.2 樣品前處理方法的選擇 在采用相同溶劑的條件下，超聲提取效率和回流提取效率相當，由于回流法過程煩瑣，易造成損失而且綠原酸受熱不穩定不宜熱提［7］，且考慮到超聲提取操作步驟簡便，于是選用超聲法。溶劑種類考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇;溶劑體積考察了15、20、30ml;超聲時間考察了15、30、45min。結果以20ml、70%甲醇提取30min效果較好。所以樣品采用70%甲醇20ml超聲提取30min作為前處理條件。

3.3 液相條件的選擇

3.2.1 流動相的選擇 本實驗嘗試了0.1%磷酸水溶液－甲醇、0.2%磷酸水溶液－甲醇、0.1%磷酸水溶液－乙腈等多種流動相系統。經過試驗，發現以甲醇－0.1%磷酸水溶液作為流動相體系，不僅3種成分的峰型良好且與雜質峰的分離度均能達到要求，故最終選用0.1%磷酸水溶液－甲醇作為流動相。

3.3.2 洗脫條件的摸索 選擇合適的洗脫條件對樣品的有效分離起著關鍵的作用。本制劑為中成藥，成分較復雜，且3種成分極性差異大，采用等度洗脫難以達到分離效果。通過考察不同梯度配比的流動相，最終確定本方法采用的梯度洗脫的方法，可將被測成分與其他雜質峰有效分離，色譜基線平穩，分離度、拖尾因子等色譜參數都能達到要求。

［1］中華人民共和國衛生部藥品標準［S］.中藥成方制劑.第七冊，1993:75.

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［10］HLPC法測定抗菌消炎片中黃芩苷的含量［J］.齊魯藥事，2010，29:08.