側腦室注射鏈脲佐菌素對大鼠海馬tau蛋白過磷酸化表達的影響

陳玉靜，田金洲，尹軍祥，時 晶，黃小波

(1.首都醫科大學宣武醫院 中醫科，北京 100053；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100053)

tau蛋白和Aβ是阿爾茨海默病(AD)的兩大病理特征，圍繞著二者在AD中的致病機理及治療對策學術界已開展了一系列研究,以往大多數研究人員把目光集中在以Aβ為目標靶點的藥物研發上，但臨床研究結果不甚滿意，因此，越來越多的研究者已經開始考慮改變AD的藥物開發策略。隨著以tau蛋白異常磷酸化為靶點的AD發病分子機制研究的不斷深入，以tau蛋白為靶標的AD藥物研發吸引了越來越多的研究者。近年來有學者[1-2]應用側腦室注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)制備擬AD模型。本研究將在前期研究基礎上觀察側腦室注射鏈脲佐菌素(ICV-STZ)對腦內tau蛋白磷酸化的影響,為該模型的進一步應用和AD的藥物研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體重250～300 g,購自北京維通利華實驗動物中心(合格證號：SCXK京2006-0008)。實驗過程中動物自由攝食和飲水(術前禁食除外)，室溫22 ℃～26 ℃,濕度28%～30%。30只大鼠隨機分成假手術組(對照組)和STZ側腦室注射組(模型組),每組15只。參考Sharma等[2]研究方法，所有大鼠經10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上,常規消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。除假手術組外，其余組動物均用微量注射器每側側腦室各注射STZ(Merck)約15～18 μL(3 mg/kg,注射前將STZ溶于生理鹽水，濃度為25 mg/mL)。坐標參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》[3]:前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm。第3天重復注射,劑量同前。假手術組操作同前，以等量生理鹽水替代STZ。

1.2 外周血糖檢測 分別于術前和術后尾靜脈采血,微量血糖儀(Roche)測定外周血糖。

1.3 動物取材 每組各取5只大鼠應用4%中性多聚甲醛經心肌灌注固定，完整取出鼠腦,置后固定液中，腦下沉后即可冰凍切片，行免疫組織化學染色。其余動物在麻醉狀態下斷頭取腦，冰盒上迅速分離海馬組織，稱重，置于eppendorf管中。經Folin酚比色法對腦組織進行蛋白定量，行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.4 免疫組織化學染色及定量分析 免疫組織化學染色采取漂浮染色法,每只大鼠于海馬CA1區連續切片,片厚45 μm,采用抗生物素蛋白-生物復合物(ABC)法進行染色，經過1N的HCl修復后，給予3%H2O2消除內源性過氧化物酶的影響，用山羊血清封閉后，加入一抗。一抗為小鼠多克隆抗體tau-1(識別tau蛋白非磷酸化Ser199/202位點)、兔多克隆抗體pS199/202和pS396/404(分別識別tau蛋白磷酸化Ser199/202和396/404位點),4 ℃過夜。加入生物素標記的二抗(稀釋度為1∶300)，孵育2 h后,再加入稀釋度為1∶300的生物素抗體過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，室溫、搖床孵育2 h；DAB顯色。每組大鼠各5只，每只鼠腦取3張相同部位的腦切片，共取15張切片計數。采用Kodak圖像分析系統及Image-Proplus軟件,在10倍物鏡下,計算各組海馬CA1區域內tau-1、pS199/202和pS396/404的陽性神經元數目。

1.5 免疫印跡分析 各組大鼠在麻醉狀態下斷頭取腦，冰盒上迅速分離海馬組織，稱重，置于eppendorf管中。經Folin酚比色法對腦組織進行蛋白定量，加入上樣緩沖液，煮沸4 min，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后，用tau-1、pS199/202和pS396/404抗體作用1 h，二抗孵育，顯色，掃描儀掃描電泳條帶。

2 結果

2.1 外周血糖檢測 造模后所有動物常規飼養,死亡率約10%。ICV-STZ模型組和對照組術前和術后(取材前)相比，外周血糖無差異。

2.2 免疫組化結果 見表1。

表1 海馬CA1區不同抗體陽性神經細胞數目

2.3 免疫印跡結果 與對照組比較，模型組大鼠海馬tau-1條帶明顯變淺，表明蛋白含量降低；pS199/202和pS396/404條帶與對照組比較,明顯增粗，表明蛋白含量增多,見圖1。

圖1 Western blotting檢測側腦室注射STZ對tau磷酸化表達的影響

3 討論

STZ是一種甲基亞硝基脲產物,對實驗動物的胰島β細胞具有高度選擇性的毒性作用，腹腔注射可導致1 型糖尿病,側腦室注射STZ 后大鼠出現空間學習記憶功能異常,伴海馬膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性降低[3]。研究發現STZ在腦內干擾胰島素和胰島素樣生長因子(IGF)信號轉導，阻斷胰島素受體自身磷酸化和內在的酪氨酸激酶活性[4]，但未引起外周血糖升高,胰腺結構和胰島素的免疫活性也未受影響;實驗中還發現ICV-STZ模型出現腦體積縮小,細胞丟失、β樣淀粉酶(Aβ)沉積增多等一系列衰老的改變，該模型在某種程度上模擬了AD的病理特征[5]，因此有學者應用側腦室注射STZ來制備癡呆模型[6-7]。

在AD腦中，與神經元丟失相伴隨出現的主要有兩大病理改變：位于神經元外由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ) 沉積構成的老年斑(senile plaque,SP)以及神經元內由異常過度磷酸化的tau蛋白構成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)[8]。其中NFT是導致神經元纖維退化的主要原因，可作為大腦早老化的標志[9],NFT的主要成分是雙股螺旋細絲(Paired helical filament,PHF)，而PHF的亞單位主要是過度磷酸化的tau蛋白。

tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白，生理情況下，tau蛋白主要定位于中樞和外周神經系統的神經元軸突內，與微管相結合，促進微管蛋白集聚和維持微管穩定性；并參與維持細胞形態、信號傳遞和軸突生長發育。tau蛋白的異常磷酸化是AD神經原纖維變性的基礎,用特異性抗體和質譜等分析技術證明:在AD腦中tau蛋白至少有21個異常磷酸化位點，異常磷酸化的tau蛋白完全喪失其生物學活性。tau蛋白參與神經原纖維纏結的形成和穩定性的維持，從而在AD神經元退變中起重要作用。因此,研究AD患者tau異常修飾的機制，對最終阻止AD病變具有指導意義。

pS199/202和pS396/404能夠識別Ser199/202和Se396/404位點的磷酸化tau蛋白，Tau-1能夠識別Ser199/202位點的非磷酸化tau蛋白。本研究中發現ICV-STZ模型大鼠體內Ser199/202和Ser396/404位點磷酸化表達增多，而tau-1的表達減少，這說明在Ser199/202和Ser396/404位點tau蛋白發生了異常磷酸化。由于本研究中選擇的位點有限，是否存在其他位點的磷酸化還有待于進一步研究。

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