蒲公英決明子(PJ)滴眼液的指紋圖譜研究

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(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004)

蒲公英決明子滴眼液(簡(jiǎn)稱PJ滴眼液)是以中藥蒲公英為君藥的中藥復(fù)方制劑，具有清熱明目、消腫解毒的功效，臨床用于治療角膜炎、結(jié)膜炎等眼部疾病，療效顯著，由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供，正準(zhǔn)備申請(qǐng)國(guó)家六類(lèi)新藥。 蒲公英性味苦、甘寒，歸肝、胃經(jīng)，有清熱解毒、消癰散結(jié)、利濕通淋作用。臨床應(yīng)用時(shí)以鮮品為佳[1]。原植物：蒲公英屬(TaraxacumWeber)植物多分布于北半球溫帶和亞寒帶地區(qū)，全世界約數(shù)百種[2]。 蒲公英具有廣譜抗菌藥理作用：蒲公英的熱水提取物(1 g/mL)可使金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膨大，細(xì)胞壁增厚，核糖體聚集成塊，有的細(xì)胞壁破裂，胞質(zhì)滲出。說(shuō)明蒲公英的抗菌作用機(jī)制是一方面通過(guò)抑制細(xì)胞壁合成，另一方面是通過(guò)抑制蛋白質(zhì)和DNA的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的[3]。劉本燕等[4]研究結(jié)果顯示蒲公英單味提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外體內(nèi)增殖有明顯抑制作用，提示對(duì)腫瘤的治療可能有一定的應(yīng)用價(jià)值。

決明子為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明C.tora L.的干燥成熟種子，具有清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效，用于治療目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)等[5]主要含有多種蒽醌類(lèi)成分[6]決明子的乙醇提取物及氯仿提取物對(duì)多種細(xì)菌均有抑制作用。程玲鈴等[7]用中藥決明子的乙醇提取物及氯仿提取物對(duì)核盤(pán)菌等10余種植物病原菌進(jìn)行抑菌活性篩選研究。結(jié)果表明決明子對(duì)植物真菌病原的抑制作用強(qiáng)于對(duì)植物細(xì)菌病原菌。

目前，指紋圖譜已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段，用它來(lái)評(píng)價(jià)中藥材及其制劑的質(zhì)量已成為我國(guó)中藥研究的熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定了10批PJ滴眼液的指紋圖譜，建立了PJ滴眼液的指紋圖譜分析方法。結(jié)果表明該方法可靠、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，適用于PJ滴眼液的質(zhì)量考察。

1 儀器與試藥

Waters 515高效液相色譜儀(515 HPLC Pump，美國(guó)Waters公司)；Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector，美國(guó)Waters公司)；Waters 2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector(美國(guó)Waters公司)；2002 Waters Empower pro工作站(美國(guó)Waters公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);島津AY-200電子分析天平(日本島津公司)；TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；色譜柱:Kromasil C18(4.6×200 mm,5 μm，中科院大連化學(xué)物理所)。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版(中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心開(kāi)發(fā)，國(guó)家藥典委員會(huì)認(rèn)可)。

甲醇(色譜醇，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠，批號(hào)：20090429041)；磷酸(分析純，南京盛躍精細(xì)化工發(fā)展有限公司，批號(hào)：20091014)；甲酸(分析純，上海久憶化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090301)；乙酸乙酯(分析純，上海申博化工有限公司，批號(hào)0907101)；水為自制重蒸水。

咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110885-200102，供含量測(cè)定用)；十批PJ滴眼液中試樣品，見(jiàn)表1。藥材均經(jīng)江蘇省中醫(yī)院中藥庫(kù)朱育鳳老師鑒定。

表1 10批PJ滴眼液批號(hào)及藥材情況

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(4.6×200 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm;柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.05%磷酸的甲醇溶液-0.05%磷酸的水溶液(梯度洗脫)；流速：1.0 mL/min；分析時(shí)間：125 min；進(jìn)樣量：供試品與參照物各20 μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

表2 指紋圖譜流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 供試品溶液的制備 精密吸取10 mL樣品溶液,置分液漏斗中，用5%甲酸的乙酸乙酯萃取5次，每次30 mL，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘?jiān)煤?%甲酸的甲醇溶液溶解并定容至10 mL，搖勻，離心取上清液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在110℃干燥至恒重的咖啡酸對(duì)照品7.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄125 min色譜，記錄對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 咖啡酸對(duì)照品色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品(批號(hào)20091109)，室溫下放置，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定,共進(jìn)樣9次，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.99，表明供試品在測(cè)定的20 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取同一批次供試品(批號(hào)20091109)，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，考察進(jìn)樣精密度，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.99，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次PJ滴眼液(批號(hào)20091109)，按供試品的制備方法分別制備5份供試品，平行測(cè)定，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.99，表明本法測(cè)定的重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的建立

3.1.1 特征峰及參照峰的選擇 在上述分析條件下，供試品與參照物溶液各進(jìn)樣20 μL，結(jié)果10批PJ滴眼液供試品溶液各成分均能得到較好的分離，所有成分的色譜峰在115 min之內(nèi)全部出現(xiàn)。

咖啡酸峰的保留時(shí)間為13.95 min，與PJ滴眼液供試品指紋圖譜對(duì)應(yīng)良好。在PJ滴眼液供試品指紋圖譜中，咖啡酸峰占總峰面積的百分比平均值約為8.1%。

從色譜圖中可以看出咖啡酸峰(RT≌13.95 min)分離較好，積分相對(duì)較大，且咖啡酸為君藥蒲公英的主要有效成分，具有一定的抗菌、抗病毒作用，與PJ滴眼液臨床作用一致，故選擇該峰作為參照峰。

3.1.2 特征峰的標(biāo)定 PJ滴眼液供試品色譜可分離出約50多個(gè)峰，經(jīng)與參照物對(duì)照以及比較所有測(cè)定和記錄的色譜圖，選取其中13個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰。參照物峰(RT≌13.95 min)標(biāo)號(hào)為S(2號(hào)峰)，其它特征峰依次標(biāo)號(hào)為1，3，4，5，……13。

10批PJ滴眼液特征峰保留時(shí)間、峰面積見(jiàn)表3、表4。

表3 10批PJ滴眼液共有指紋峰(特征峰)保留時(shí)間

表4 10批PJ滴眼液共有指紋峰(特征峰)峰面積

3.1.3 對(duì)照指紋圖譜的確定 根據(jù)10批次供試品HPLC圖譜測(cè)定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值(積分值)和峰位(相對(duì)保留時(shí)間)等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，并借助“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”，制定出優(yōu)化的對(duì)照指紋圖譜。對(duì)照指紋圖譜的特征峰保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間、峰面積及相對(duì)峰面積比值見(jiàn)表5，圖2。

表5 對(duì)照指紋圖譜的特征峰情況

圖2 PJ滴眼液對(duì)照指紋圖譜

3.1.4 共有指紋峰的標(biāo)定 根據(jù)10批供試品測(cè)定結(jié)果，標(biāo)定共有指紋峰。PJ滴眼液供試品指紋圖譜中，共有指紋峰是13個(gè)。與咖啡酸參照物峰相比，其他12個(gè)共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表6。

3.1.5 共有指紋峰面積比 5、7、8號(hào)共有指紋峰的面積超過(guò)總峰面積的10%，根據(jù)指紋圖譜的相關(guān)要求[8]，規(guī)定5號(hào)峰相對(duì)峰面積比值為1.016～1.694，規(guī)定7號(hào)峰相對(duì)峰面積比值為1.038～1.730，規(guī)定8號(hào)峰相對(duì)峰面積比值為1.094～1.824。共有指紋峰相對(duì)峰面積比值見(jiàn)表7。

表6 10批PJ滴眼液共有指紋峰(特征峰)相對(duì)保留時(shí)間表

表7 10批PJ滴眼液共有指紋峰(特征峰)相對(duì)峰面積比值表

表8 10批PJ滴眼液相似度比較結(jié)果

3.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版，通過(guò)“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，得到各批次PJ滴眼液指紋圖譜數(shù)據(jù)。結(jié)果10批相似度均為0.90以上，見(jiàn)表8。

4 小結(jié)

4.1 在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，柱溫對(duì)各色譜峰的保留時(shí)間影響較大。其原因可能是流動(dòng)相的組成中加有磷酸，柱溫通過(guò)影響流動(dòng)相中pH值而影響色譜峰的保留時(shí)間，所以在檢測(cè)過(guò)程中最好要嚴(yán)格控制柱溫，使該滴眼液的指紋圖譜檢測(cè)更加穩(wěn)定，重現(xiàn)性更好。

4.2 本文采用HPLC色譜法，初步建立了PJ滴眼液的指紋圖譜分析方法，結(jié)果表明此方法穩(wěn)定，可靠，重現(xiàn)性好，適用于PJ滴眼液的質(zhì)量考察。

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