產(chǎn)β-甘露聚糖酶環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵罐放大工藝研究

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 楊新建 段素云

β-甘露聚糖酶 （β-l，4-D-mannan mannanohydrolase，EC.3.2.l.78）是一種降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-l，4-D-甘露吡喃糖的酶。它在分解飼料中的聚糖（除去抗?fàn)I養(yǎng)的不良作用）、促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)有益菌群的繁殖、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的消化和吸收；以及通過(guò)內(nèi)分泌和免疫的途徑提高營(yíng)養(yǎng)成分 （特別是能量）的利用率、改善動(dòng)物的健康狀況、提高動(dòng)物的生產(chǎn)水平等方面具有不可替代的作用。

目前，國(guó)內(nèi)外β-甘露聚糖酶的研究非常活躍，取得的成果也頗為顯著（孫占斌和張暉，2009；唐犖等，2010；殷瑩瑩等，2009）。但是這些成果大多局限于實(shí)驗(yàn)室的搖瓶發(fā)酵，而搖瓶實(shí)驗(yàn)難以精確描述微生物代謝過(guò)程的計(jì)量學(xué)和動(dòng)力學(xué)，并且傳遞因素造成的影響難以精確在線檢測(cè)和調(diào)控，所以采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)仍是目前生物技術(shù)開(kāi)發(fā)和實(shí)驗(yàn)產(chǎn)業(yè)化的必由之路。

本試驗(yàn)通過(guò)搖瓶正交設(shè)計(jì)獲得的環(huán)狀芽孢桿菌WXY-100產(chǎn)β-甘露聚糖酶最優(yōu)培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上（楊新建等，2006），研究50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中一些操作條件的變化比如更換碳源、加入誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)劑量、補(bǔ)料、下罐時(shí)間等對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，從而為今后的放大生產(chǎn)提供可借鑒工程參數(shù)和菌種性能參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種 由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的環(huán)狀芽孢桿菌WXY-100。

1.2 儀器設(shè)備 50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐、普通搖床SHK-99-Ⅱ、分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、電磁加熱鍋SR-1670A、離心機(jī)5804R型、恒溫培養(yǎng)箱420BS等。

1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，胰蛋白酶胨 10 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.0。一級(jí)種子培養(yǎng)基：NaCl 10g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白酶胨10g/L，pH 7.2，高壓滅菌后備用。二級(jí)種子培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、甘油7.5 g/L、（NH4）2SO41 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物20 g/L、甘油20 g/L、（NH4）2SO42 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，玉米漿 5 g/L，pH 7.5。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：30%葡萄糖、5%胰蛋白胨。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種活化 將冷藏保存的菌種經(jīng)一定的倍比稀釋后分區(qū)劃線或涂布在固體培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)環(huán)狀芽孢桿菌菌落于盛有一級(jí)種子培養(yǎng)基的三角瓶中，35℃振搖培養(yǎng)（200 r/min）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末 （根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定），作為一級(jí)種子液。

按照6%的接種量，將一級(jí)種子液接種到二級(jí)種子培養(yǎng)基中，35℃振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定具體時(shí)間），作為二級(jí)種子液，該級(jí)種子作為接種發(fā)酵罐的種子。

2.2 酶活性檢測(cè) 發(fā)酵液于8000 g/min條件下離心20 min，取上清（粗酶液），據(jù)DNS法進(jìn)行酶活測(cè)定。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 碳源的更換對(duì)發(fā)酵的影響 根據(jù)實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源摩芋粉更換為甘油，比較二者在酶活性、發(fā)酵時(shí)間等各個(gè)方面的優(yōu)劣。

2.3.2 誘導(dǎo)劑劑量的確定 在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，分別加入0%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的誘導(dǎo)劑（瓜爾豆膠），根據(jù)最終的酶活性大小確定最佳的誘導(dǎo)劑量 （Seiji Yoshida等，1998）。

2.3.3 純氧的攝入對(duì)產(chǎn)酶的影響 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后半段，通過(guò)加入純氧來(lái)調(diào)節(jié)溶氧的大小，根據(jù)下罐的發(fā)酵液的酶活性大小來(lái)確定加入純氧的必要性。

2.3.4 pH值的變化對(duì)產(chǎn)酶的影響 針對(duì)實(shí)際過(guò)程，設(shè)計(jì)下面三種情況：一是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH值不發(fā)生變化為7.0；二是發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)階段pH值不發(fā)生變化為7.0，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（誘導(dǎo)點(diǎn)）升高pH值為7.5；三是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH值不發(fā)生變化為7.5。根據(jù)最終酶活性高低確定最佳的pH變化過(guò)程。

2.3.5 補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響 根據(jù)溶氧判斷菌體對(duì)養(yǎng)分的消耗情況，采用流加的方式進(jìn)行補(bǔ)料，根據(jù)最終的酶活性大小來(lái)確定補(bǔ)料的作用。

2.3.6 發(fā)酵終點(diǎn)的確定 分別取誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液，進(jìn)行酶活性測(cè)定，以確定最高產(chǎn)酶點(diǎn)，也即是發(fā)酵液下罐時(shí)間。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 碳源的更換對(duì)發(fā)酵的影響 分別以摩芋粉、甘油作為碳源進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同碳源相應(yīng)數(shù)據(jù)的比較

上述結(jié)果顯示，以魔芋粉為碳源只在最高酶活性方面優(yōu)于甘油，但在性?xún)r(jià)比方面卻以甘油為佳，因此在發(fā)酵罐放大試驗(yàn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源改為甘油。

3.2 誘導(dǎo)劑劑量的確定 在細(xì)菌生長(zhǎng)期階段，加入0.05%的瓜爾豆膠2～3次，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（根據(jù)溶氧判斷），分別加入0%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的瓜爾豆膠，酶活性大小比較見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，當(dāng)誘導(dǎo)劑的加入量為0.5%時(shí)，酶活相對(duì)最高。

圖1 不同劑量誘導(dǎo)劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

3.3 純氧的攝入與否對(duì)產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵的開(kāi)始階段，主要以改變攪拌速度來(lái)控制溶氧，純氧的攝入主要在攪拌速度不能有效控制溶氧之后（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后2 h左右），具體見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后半段，在改變攪拌速度不能有效提供充足溶氧的情況下加入純氧，不但能加快菌體的生長(zhǎng)和繁殖，還能夠提高菌體最終的產(chǎn)酶效率。

3.4 pH值的變化對(duì)產(chǎn)酶的影響 根據(jù)最終的酶活性大小，三種情況的比較見(jiàn)圖2。

表2 純氧的攝入對(duì)產(chǎn)酶的影響

結(jié)果顯示，第二組，也就是發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)階段pH值不發(fā)生變化為7.0，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（誘導(dǎo)點(diǎn)）升高pH值為7.5的情況下，酶活相對(duì)較高。

圖2 pH值的變化對(duì)產(chǎn)酶的影響

3.5 補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，養(yǎng)分消耗殆盡（至少碳、氮源消耗完畢），此時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。最終結(jié)果顯示，酶活性并沒(méi)有質(zhì)的提高，還是在5×105U/L左右。

3.6 發(fā)酵終點(diǎn)的確定 選取誘導(dǎo)劑劑量為0.4%和0.3%的兩次發(fā)酵過(guò)程作為研究對(duì)象，測(cè)量其誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)間段的酶活性大小，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)間段的酶活性大小

結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)后4～5 h為最佳下罐時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)酶活最高。

4 討論

4.1 碳源的更換對(duì)發(fā)酵的影響 之所以在發(fā)酵放大階段更換碳源，在于含有2%的摩芋粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓滅菌之后黏稠度很大，占據(jù)了大量的水分，使發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧一直處于很低的狀態(tài)，而目的菌（環(huán)狀芽孢桿菌）是一種喜氧菌，其生長(zhǎng)過(guò)程需要大量的氧，如果系統(tǒng)供氧不足或者溶氧在其臨界氧之下，將嚴(yán)重影響該菌的生長(zhǎng)繁殖及其代謝產(chǎn)物的生成。另外根據(jù)3.1的結(jié)果，以摩芋粉為碳源，菌體有一個(gè)很長(zhǎng)的延滯期，生長(zhǎng)過(guò)程也比較漫長(zhǎng)，整個(gè)過(guò)程更是長(zhǎng)達(dá)33 h，最終也影響到酶活。在此情況下，考慮到碳分解代謝物阻礙效應(yīng)，選擇了甘油作為發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源 （其他聚糖也與摩芋粉一樣存在上述問(wèn)題）。而甘油能與水互溶，這樣就釋放了大量的水，可以保證在菌體生長(zhǎng)的初始階段獲得足夠的氧。從結(jié)果來(lái)看，這樣不但縮短了發(fā)酵的時(shí)間，從性?xún)r(jià)比上也要比摩芋粉作為碳源高。由于目的產(chǎn)物β-甘露聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，所以當(dāng)以甘油為碳源的時(shí)候，需加入一種聚糖作為誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生。

4.2 誘導(dǎo)劑對(duì)酶活的影響 β-甘露聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，其誘導(dǎo)劑選擇了可以作為其基質(zhì)的聚糖瓜爾豆膠。對(duì)于其劑量的確定，采用比較簡(jiǎn)單的酶比活來(lái)進(jìn)行直接的定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以0.5%為最佳的誘導(dǎo)劑量，同時(shí)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間加入2～3次的劑量為0.05%的誘導(dǎo)劑，可以加強(qiáng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末的誘導(dǎo)效果。

4.3 純氧的攝入對(duì)產(chǎn)酶的影響 實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程中，通氣量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是不變的，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前半段主要通過(guò)控制轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)溶氧，開(kāi)始轉(zhuǎn)速每提高100 r/min，溶氧可以從30%提高到80%左右，但到500 r/min之后，再提高轉(zhuǎn)速溶氧變化不大，并且溶氧處在臨界氧（30%）之下，這將嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的合成。鑒于此，當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到500 r/min之后，采用加入純氧的形式來(lái)保證菌體的氧氣需要 （使溶液的溶氧達(dá)到80%左右），直至達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（溶氧值突然上升，并超過(guò)100%）。此后加入誘導(dǎo)劑，并維持至下罐結(jié)束。

從實(shí)際的結(jié)果看，純氧的攝入彌補(bǔ)了由于溶氧不足引起的菌體生長(zhǎng)緩慢的情況，并能提高最終酶的活性。

4.4 pH值的變化對(duì)產(chǎn)酶的影響 對(duì)于微生物來(lái)講，適合其生長(zhǎng)的pH值不一定是其產(chǎn)物合成時(shí)期的最適pH值，因此實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程中，在菌體的不同階段要提供其合適的pH值。相反，不合適的pH值會(huì)影響各種酶活、菌體對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的代謝，從而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木渥钸m生長(zhǎng)pH值為7.0，而在菌體生長(zhǎng)階段，由于產(chǎn)生大量的酸，溶液pH值下降很快，此時(shí)通過(guò)加入堿液（NaOH或者氨水）來(lái)調(diào)節(jié)其在7.0左右，以維持菌體正常生長(zhǎng)。到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末時(shí)，菌體進(jìn)入生產(chǎn)期，根據(jù)前期的研究結(jié)果 （楊新建等，2006），此時(shí)提高溶液pH值為7.5，以利于目的產(chǎn)物的合成。在產(chǎn)物合成后期，溶液的pH值會(huì)因?yàn)榫w的衰亡而升高，此時(shí)需要加入相應(yīng)的酸液來(lái)控制pH值穩(wěn)定在7.5，因?yàn)檫^(guò)高的pH值會(huì)降低最終目的產(chǎn)物的活性。實(shí)際結(jié)果顯示，在菌體生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期提供不同的適合的pH值，對(duì)目的產(chǎn)物的合成有一定的促進(jìn)作用。

4.5 補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響 補(bǔ)料的結(jié)果不理想，其原因很可能是多方面的。首先，補(bǔ)入的是葡萄糖，而發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為甘油，同時(shí)葡萄糖還可能存在碳分解代謝阻礙；其次，補(bǔ)料的時(shí)間以及補(bǔ)料的方式，還有待研究。在一般的情況之下，如果補(bǔ)料的時(shí)機(jī)和方式把握準(zhǔn)確，相應(yīng)的結(jié)果都要比不補(bǔ)的情況好，而本結(jié)果卻與之相反，因此，今后要加強(qiáng)這方面研究，將其作為提高酶活的一個(gè)突破點(diǎn)。

4.6 發(fā)酵終點(diǎn)的判斷 發(fā)酵終點(diǎn)也即是下罐時(shí)間，發(fā)酵的目的就是要得到比較高的酶活性，就是單位體積內(nèi)產(chǎn)物量最多，因此在單位體積內(nèi)酶活性最高點(diǎn)結(jié)束發(fā)酵。

對(duì)于不同的發(fā)酵類(lèi)型以及發(fā)酵目的，發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)有所不同。如提高產(chǎn)率，就要縮短發(fā)酵時(shí)間；如要提高產(chǎn)物濃度，就要延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵終點(diǎn)的選擇對(duì)下游工序有很大的影響，下罐時(shí)間過(guò)早，會(huì)殘留過(guò)多的養(yǎng)分（如糖、脂肪、可溶性蛋白等），增加提取工序的負(fù)擔(dān)（這些物質(zhì)的乳化作用會(huì)干擾樹(shù)脂的交換）；下罐時(shí)間過(guò)晚，菌體自溶，不僅會(huì)延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間，還可能使一些不穩(wěn)定的產(chǎn)物濃度下跌，擾亂提取工序的作業(yè)計(jì)劃。

5 小結(jié)

以環(huán)狀芽孢桿菌WXY-100為研究對(duì)象，研究了該菌在50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中更換C源、誘導(dǎo)劑量、純氧的攝入、pH值的變化、補(bǔ)料、下罐時(shí)間等條件對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源改為甘油，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末加入0.5%的誘導(dǎo)劑，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后半段攝入純氧，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（誘導(dǎo)點(diǎn)）將pH值從7.0升高為7.5，酶活相對(duì)較高；并在誘導(dǎo)后4～5 h為最佳下罐時(shí)間點(diǎn)；而補(bǔ)料的效果不明顯。

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