航天誘變菌株黑曲霉ZM-8降解小麥秸稈產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)院 馬旭光 張宗舟

利用微生物酶解法預(yù)處理纖維素資源與傳統(tǒng)的物理處理法、化學(xué)處理法相比，具有節(jié)約能源、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少或無(wú)副產(chǎn)物、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。微生物產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)纖維素的降解是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，受原料成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH值、培養(yǎng)時(shí)間等眾多因素的影響（蔣芳等，2006；徐昶等，2005；王景林等，2000）。因此，在具有性價(jià)比較高的纖維素酶產(chǎn)生菌株的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其分泌纖維素酶的各種條件就顯得至關(guān)重要。

本試驗(yàn)在前期已確定影響黑曲霉ZM-8在小麥秸稈為主要原料產(chǎn)纖維素酶的單因素研究基礎(chǔ)上（馬旭光等，2008），應(yīng)用正交試驗(yàn)對(duì)各單因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為提高農(nóng)作物秸稈的利用效率、拓寬其飼用范圍提供可靠的工藝參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種 航天誘變黑曲霉 （Aspergillus niger）突變株ZM-8（馬旭光等，2007），保存于PDA斜面培養(yǎng)基。

1.2 發(fā)酵主要原料 小麥秸稈粉 （過(guò)40目篩），麩皮（市售）。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DNS試劑，檸檬酸緩沖液，水楊素（Sigma），羧甲基纖維素鈉，新華定性濾紙，其他均為國(guó)產(chǎn)的化學(xué)純或分析純。

1.3.2 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱；高速冷凍離心機(jī)；722型分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋等。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 種子培養(yǎng)基 小麥秸稈粉10 g，營(yíng)養(yǎng)液[（2% （NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25 mL。

1.4.2 固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基 小麥秸稈粉6g，麩皮4g，營(yíng)養(yǎng)液[（2.0%（NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25mL。

上述培養(yǎng)基均需在 1.0×105Pa，121℃滅菌30 min，pH 值自然。

2 試驗(yàn)方法

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分的優(yōu)化 在前期單因素研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)中的麩皮添加量、氮源、含氮量以及水料比等都會(huì)不同程度地影響酶活力 （馬旭光等，2008）。 本試驗(yàn)采用 L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素水平

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化 前期的單因素研究表明，培養(yǎng)時(shí)間、溫度、初始pH值和接種量都會(huì)對(duì)酶活有不同的影響（馬旭光等，2008）。本試驗(yàn)均采用L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素水平

2.3 復(fù)證 在已確定的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件下測(cè)定酶活，并與在未優(yōu)化培養(yǎng)基上的酶活力進(jìn)行比較，以驗(yàn)證優(yōu)化效果。

3 測(cè)定方法

3.1 發(fā)酵方法 將黑曲霉ZM-8的斜面孢子用無(wú)菌生理鹽水洗脫，制成孢子懸浮液 （106～107個(gè)/mL），按10%（V/m）的接種量接入種子培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)72 h，待菌絲生長(zhǎng)旺盛、孢子叢生時(shí)即可放入冰箱保存，供種曲備用。然后將制備的種曲按一定比例接入固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)72 h后取樣測(cè)定酶活。

3.2 粗酶液的制備 取生長(zhǎng)良好的固體發(fā)酵曲5 g，加水 50 mL，于 30℃保溫 1 h，用沙芯漏斗過(guò)濾，然后在轉(zhuǎn)速10000 r/min冷凍離心機(jī)上離心10 min，提取上清液定容至 100 mL，得 1∶20粗酶液。

3.3 酶活力的測(cè)定

3.3.1 FPU酶（濾紙酶）活力的測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入50 mg濾紙條 （約1 cm×6 cm）和1.5 mL 0.05 mol/L的緩沖液，并向?qū)φ赵嚬苤屑尤?.5 mLDNS溶液以鈍化酶活性，然后在50℃保溫1 h，取出后立即向待測(cè)試管中加入1.5 mLDNS溶液以中止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5 min，冷卻后在540 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度值。

3.3.2 CMC酶（內(nèi)切酶）活力的測(cè)定 加入的底物為1.5 mL 0.51%CMC緩沖液，在50℃水浴中保溫0.5 h，其余操作同3.3.1。

3.3.3 纖維素酶活力單位定義 在50℃，pH 4.8，恒溫30 min條件下以水解反應(yīng)中每小時(shí)由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）（鄔敏辰等，1997）。 計(jì)算公式為：

式中：5.56為1 mg葡萄糖的μmol數(shù)（1000/180=5.56）。

樣品重為發(fā)酵后的固體干曲重量。

3.3.4 數(shù)據(jù)分析及處理方法 參考李春喜等（2000）對(duì)正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用DPS軟件進(jìn)行極差分析。

4 結(jié)果與分析

4.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分的優(yōu)化結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，各因素對(duì)FPU酶活力的影響大小順序?yàn)?A（含氮量）、B（氮源）、D（麩皮加入量）、C（加水量）。其最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為A3B2D2C2，即含氮量1.0%、氮源為碳酸銨、小麥秸稈與麩皮之比4∶1、料水比為1∶2。 對(duì)CMC酶活力的影響大小順序?yàn)?B（氮源）、C（加水量）、A（含氮量）、D（麩皮加入量）。其最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為：B2C2A4D2，即：氮源為碳酸銨，料水比為 1∶2，含氮量為1.4%，小麥秸稈粉與麩皮之比4∶1。

表3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分的正交試驗(yàn)極差分析

FPU是表征纖維素酶系中各組分酶之間的協(xié)同作用（徐昶等，2005），而CMC酶活代表外切β-1，4葡聚糖酶活力和內(nèi)切酶活力的總和 （孔健，2005），再根據(jù)各因素對(duì)纖維素酶的影響大小，最終將產(chǎn)酶培養(yǎng)基確定為：氮源為碳酸銨、料水比為1∶2、含氮量 1.4%、秸稈粉與麩皮之比為 4∶1。

4.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，其FPU酶較佳產(chǎn)酶條件為A3B3D1C4，即：培養(yǎng)溫度為 32 ℃，pH 值為 6.5，接種量為4%，培養(yǎng)時(shí)間為96 h。CMC酶的較佳產(chǎn)酶條件為A2C3B3D1，即：培養(yǎng)溫度為28℃，pH值為6.5，接種量為4%。培養(yǎng)時(shí)間為72 h，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間是影響CMC產(chǎn)酶的主要因素；培養(yǎng)溫度對(duì)FPU的影響大于pH值和培養(yǎng)時(shí)間，其極差小于CMC酶；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FPU的影響較大，其極差遠(yuǎn)大于CMC酶；pH值和接種量對(duì)兩種酶活的影響都不明顯。綜合上述分析，可將黑曲霉產(chǎn)酶的最佳條件確定為：C4A2B3D1。

表4 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)極差分析

4.3 復(fù)證 在已確定的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件下測(cè)定酶活，即培養(yǎng)基配方：氮源為碳酸銨，含氮量1.4%、料水比為1∶2、小麥秸稈粉與麩皮之比為4∶1；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為28℃、培養(yǎng)時(shí)間為96 h、初始pH值為6.5、接種量為4%。測(cè)定結(jié)果表明：FPU和CMC的酶活分別為6.57 U/g和22.38 U/g。

5 小結(jié)

5.1 含氮量和加水量是影響產(chǎn)酶的最主要因素，其產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分的最優(yōu)組合為：最佳氮源為碳酸銨，含氮量1.4%，料水比為1∶2，小麥秸稈粉與麩皮之比為 4∶1。

5.2 培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度是影響產(chǎn)酶的最主要環(huán)境因子，其產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為 96 h，pH值為6.5，接種量4%。

5.3 在優(yōu)化的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件下，其FPU和CMC的酶活分別為6.57 U/g和22.38 U/g。

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