強脈沖光對人皮膚MMP-1、MMP-8及TIMP-1表達的影響

袁 寧 趙俊英

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院皮膚科，北京 100050)

光子嫩膚技術是使用連續波長的強脈沖光(intense pulsed light，IPL)在低能量密度下進行的非剝脫性、非侵入性嫩膚治療技術。作為一種無創的嫩膚手段，近年來深受廣大患者及從業醫生的青睞。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與細胞外基質降解的主要蛋白酶。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是一族內源性抑制因子，可以高度地、有選擇地抑制MMPs或其前體而表現出許多生物學活性，2者維持著細胞外基質的平衡。

本實驗通過采用免疫組化法檢測光照前后人皮膚中MMPs和TIMP的表達，以明確2者在舊基質的降解和新生基質的重排過程中所起的作用，通過基質與酶的變化的相關性研究，進一步闡述強脈沖光光子嫩膚的作用機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取6名就診于首都醫科大學附屬北京友誼皮膚科的患者，皮膚類型為Ⅲ～Ⅳ型(Fitzpatrick分型)，年齡28～46歲，男7例，女3例。患者均簽署病理學取材的知情同意書。

1.2 主要儀器

全自動脫水機、自動石蠟包埋機、石蠟切片機、電熱恒溫烤箱(均來自德國Leica公司)，光學顯微鏡及照相系統(日本Olympus公司)，Lumenis One光子嫩膚儀(美國科醫人公司)。

1.3 主要試劑

兔抗人基質金屬蛋白酶I單克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶Ⅷ單克隆抗體(武漢Boster公司)，兔抗人血管內皮生長因子單克隆抗體、兔抗人金屬蛋白酶組織抑制因子Ⅰ多克隆抗體、試劑A聚合物輔助劑、試劑B辣根酶標記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體(北京中杉金橋公司)。

1.4 研究方法

志愿者照光部位(2例為左腹部，4例為上肢)0.9%氯化鈉注射液清潔后，皮膚表面涂IPL冷凝膠，進行強脈沖光嫩膚治療。根據受試者Fitzpatrick分型、膚色、皮損性質、部位、密度等制定個體化治療方案，選擇恰當的IPL治療參數560 nm/590 nm的濾光片，采取單/雙/三脈沖的不同脈沖方式，脈寬為2.0～4.0 ms，脈沖延遲為 25～40 ms，能量密度為 16-20 J/cm2，治療間隔為3周，治療次數為3～4次。

1.5 組織學觀察

分別于照光部位及其周邊非照光部位各取1塊皮膚，裁剪成約5 mm×5 mm×5 mm大小，2例志愿者3次治療后2周病理取材，2例3次治療后3周病理取材，2例4次治療后3周病理取材。所有皮膚樣本均以10%甲醛緩沖固定液固定待用。固定的標本石蠟包埋、切片，厚度3 μm，APES膠片撈片后置烤箱60℃，進行常規免疫組化染色。光鏡下觀察。

1.6 結果判斷

MMP-1、MMP-8、TIMP-1表達陽性時，在切片中可見胞質內有深淺不同的棕黃色顆粒，按照所有標本的平均染色強度由無到強劃分為 －，+，++，+++四級［1］。

2 結果

2.1 MMP-1在皮膚中的表達

抗原陽性時在切片中可以看到棕黃色顆粒。從切片中可以看到，正常皮膚中無MMP-1表達(圖1A，顆粒層深色顆粒為色素沉著)，3次IPL照射后2周陽性表達較照射前增強(圖1B)，3周時的表達較照射前也有所增強(圖1C)，但弱于照射2周時的表達。從圖1B、1D可以看出，4次IPL照射后皮膚中的MMP-1陽性表達較3次IPL照射后的表達多。圖1B顯示，腹部皮膚經IPL照射后，MMP-1的表達也有所改變。

2.2 MMP-8在皮膚中的表達

抗原陽性時切片中可以看到棕黃色顆粒。正常皮膚中無MMP-8表達(圖2A)。3次IPL照射后2周有陽性表達，真皮中可見表達陽性棕黃色顆粒(圖2B)，照射后3周時皮膚真皮中也有所表達(圖2C)，但弱于照射2周時的表達。4次IPL照射的皮膚真皮中陽性表達(圖2D)強于3次照射后的表達。圖2D示腹部皮膚照射前后的MMP-8的表達也有所改變。而且，整體看來，MMP-8在真皮中的表達弱于MMP-1的表達。

2.3 TIMP-1在皮膚中的表達

正常皮膚中無TIMP-1表達(圖3A)，3次IPL照射后2周真皮有陽性顆粒出現(圖3B)，第3周時的表達較照射前也有所增強(圖3C)，與2周時的表達相比無明顯改變。4次IPL照射后2周時真皮層有較多陽性顆粒出現，并有成纖維細胞表達陽性(圖3D)。

3 討論

皮膚老化一直是人們關注的熱點問題。光子嫩膚技術是使用連續的強脈沖光在低能量密度下的非消融性方式的嫩膚治療，簡言之是采用強光源對光老化的皮膚進行改善。Anderson R R等［1］在1983年首次提出光子嫩膚作用機制為選擇性光熱解效應:如果皮膚中的病損組織對光輻射產生選擇性吸收，并將產生的熱能限制在一定空間內，那么在此區域內的生物組織受到熱破壞，而周圍的正常組織不受損害，病損組織吸收熱能被分解，并通過代謝吸收分解產物。

正常皮膚中最為豐富的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分就是膠原，最豐富的膠原類型是Ⅰ型膠原，占皮膚膠原的80%～85%，且是人體的主要結構蛋白，其次是Ⅲ型膠原，占10%左右。而光老化的主要組織學特征是皮膚基質構成的改變，即膠原成分的減少和異常彈性纖維沉積［2］。此時重建結締組織，這需要細胞外基質組成成分的降解和清除，以及新成分的合成和沉積。所以，膠原的合成和降解在此過程中的重要性是顯然的。

許多酶可降解ECM中的膠原成分，分為4大類:絲氨酸蛋白酶類、半胱氨酸蛋白酶類、天冬氨酸蛋白酶類、基質金屬蛋白酶類。其中，MMPs是一組降解ECM的最重要的蛋白酶［3-4］。

圖1 MMP-1在皮膚中的表達免疫組化染色Fig.1 Expression of MMP-1 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

其中MMP-1，MMP-8以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白為底物。在正常機體中，MMPs的活性非常低并由內源性的組織抑制劑TIMPs調節。TIMPs是阻斷ECM降解、抑制MMP活性的一組分泌糖蛋白。它是一個多基因家族的編碼蛋白，由成纖維細胞、角質細胞、單核-巨噬細胞、內皮細胞等產生，廣泛分布于組織和體液中。目前已被成功克隆出 4個成員:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4［5-7］。TIMP 在組織重塑中的主要作用是與MMP形成1∶1復合物從而抑制MMP的能力。2者維持著細胞外基質的平衡。雖然每種TIMP均可抑制所有的MMP，但TIMP-1可優先抑制MMP-1。

本實驗前期研究［8］對IPL治療前后彈力纖維的圖像定量分析結果顯示其面積密度以降低為主，但肉眼觀察切片中聚集成團塊狀的彈力纖維消失，取而代之的是較為纖細、分布更廣、排列更加均勻整齊的新的彈力纖維，另外Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的面積密度以增加為主，且其排列更加整齊并交織成規則的網狀結構，纖維間間隙明顯縮小，纖維排列致密，纖維的直徑明顯變細，說明膠原纖維為更加幼稚的新生的膠原纖維。我們懷疑是某些細胞在接受光能后分泌某種酶及細胞因子，刺激新的膠原生成。到目前為止，研究IPL的分子生物學機制方面的報道還很少，因此有必要進行較深入的該方面研究，這對于IPL的應用將有重要的理論意義。

本實驗表明正常皮膚中無MMP-1表達，IPL照射后真皮中發現MMP-1及MMP-8的表達增強，此時MMP-1及MMP-8的表達有利于清除變性的膠原。而照射后3周時的陽性表達弱于照射2周時的表達，這時有利于新的膠原纖維形成，這與我們前期實驗觀察切片中特染組織的面積及厚度的改變，發現第3周時Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的改變呈上升趨勢相吻合。同時，從本研究結果可以顯示，4次IPL照射后皮膚中的MMP-1陽性表達較3次IPL照射后的表達強。所以，增加治療次數，將會清除更多的變性Ⅰ、Ⅲ型膠原，從而有更多新生膠原纖維生成。

圖2 MMP-8在皮膚中的表達免疫組化染色Fig.2 Expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

正常皮膚中TIMP-1無表達，IPL照射后真皮有陽性顆粒出現，但第2周和第3周時真皮內表達差異無統計學意義，有成纖維細胞表達陽性。

TIMP-1的一個重要作用就是抑制 MMP-1及MMP-8對ECM成分的降解。實驗中我們發現MMPs在2周時的表達強于3周時的表達，而TIMP-1在真皮中的表達在第2周和第3周無明顯差異，這表示，在2周前主要是以清除變性膠原為主，而2周后，TIMP抑制MMPs對膠原的過多降解，有利于真皮中新生基質成分的沉積，對皮膚的重塑是有意義的。此過程中，TIMP-1一直起監察員的作用。

國內王明利等［9］對大鼠皮膚的強脈沖光實驗研究也證實了這一變化，但是我們未觀察到強脈沖光治療后這些酶在漢族人皮膚上的強陽性表達，考慮可能與以下因素有關:① 照射對象及部位:前者是大鼠背部皮膚，本實驗是漢族人的上肢及腹部皮膚。② 治療參數:前者通過測試光斑，用了相同的治療參數:能量密度34 J/cm2，脈寬各為4、5及6 ms，脈沖延時為20 ms及25 ms。本實驗根據受試者Fitzpatrick分型、膚色、部位等制定個體化治療方案，選擇恰當的IPL治療參數:560 nm/590 nm的濾光片，采取單/雙/三脈沖的不同脈沖方式，脈寬為2.0～4.0 ms，脈沖延遲為25～40 ms，能量密度為16～20 J/cm2，這與我們在臨床應用時所用的治療參數是相似的。

研究者還觀察到，腹部皮膚經IPL照射后的MMP-1、MMP-8及TIMP-1在真皮中表達也增強，且其規律性和光暴露部位(上肢)的陽性表達相似，因此認為IPL不僅能治療光老化，并且對自然老化也有一定的療效。

本實驗觀察了IPL作用于人皮膚中的MMP-1、MMP-8及TIMP-1的表達變化，表明3者在光子嫩膚導致的熱損傷中起一定的作用，為闡明IPL的分子生物學機制提供了一定的理論基礎。IPL的分子生物學機制還涉及很多的酶和因子，本實驗只觀察了3種酶的變化，其他酶和因子在IPL作用機制中的變化及相關關系還有待于進一步的研究。

圖3 TIMP-1的表達免疫組化染色Fig.3 The expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain)

［1］Anderson R R，Parrish J A.Selective photothermolysis:precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation［J］.Science，1983，220(4596):524-527.

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［3］Duarte A S，Pereira A O，Cabrita A M.The characterisation of the collagenolytic activity of cardosin a demonstrates its potential application for extracellular matrix degradative processes［J］.Curr Drug Discov Technol，2005，2(1):37-44.

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［8］馮育潔，趙俊英.強脈沖光嫩膚療效評價及病理變化的研究［J］.中華醫學雜志，2007，87(20):1394-1397.

［9］王明利，柳大烈.強脈沖光對大鼠皮膚膠原蛋白及其調控因素的影響［D］.西安:第四軍醫大學，2005.