黃芩莖葉黃酮對(duì)大鼠缺血性記憶障礙的改善作用及對(duì)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和一氧化氮合酶蛋白表達(dá)的影響

王玉梅 曹 凱 劉永平 秦博文 商亞珍

(河北省重要研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000)

慢性腦缺血是指各種原因引起長(zhǎng)期的腦灌流不足，伴發(fā)于多種臨床神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、血管性癡呆及阿爾茨海默病等。而這些疾病的發(fā)生涉及膽堿能系統(tǒng)、一氧化氮、興奮性氨基酸、線粒體損傷及氧化自由基系統(tǒng)等多方面［1-2］。其中膽堿能系統(tǒng)和一氧化氮及其合成酶的異常變化與腦缺血損傷引起的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)，已經(jīng)得到研究人員的高度重視。

目前，在臨床上采用一系列方法治療腦缺血引起的神經(jīng)損傷，而中藥復(fù)方或其提取活性成分在防治缺血性腦損傷方面已顯示出良好的效果，并已成為研究的熱點(diǎn)。黃芩莖葉黃酮(flavonoids from stem and leaf of scutellaria baicalensis georgi，SSF)是從中藥黃芩地上部分提取分離的黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)室先前利用多種體內(nèi)外模型已經(jīng)確定了SSF具有抗炎、抗氧化、抗缺氧和改善記憶障礙等作用［3-6］。本研究采用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立慢性腦缺血模型，利用大鼠Morris水迷宮行為實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)的方法，進(jìn)一步探討SSF對(duì)腦缺血性記憶障礙的改善作用，并通過測(cè)定腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloine acetyltransferase，ChAT)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)蛋白表達(dá)揭示其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康雌性SD大鼠300～320 g，購買于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào):90912);SSF(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供);抗ChAT、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 大鼠慢性腦缺血模型制備及分組給藥

60只雌性SD大鼠，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。稱體質(zhì)量后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(mL/kg)。取仰臥位將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，去毛剪頸內(nèi)部去毛、強(qiáng)力碘消毒后沿頸正中切開，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并套以“0”號(hào)線，待動(dòng)物清醒后結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組大鼠(8只)做同樣手術(shù)但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。手術(shù)期間確保大鼠能自主呼吸且肛溫保持在31.5℃～37.5℃。術(shù)后每只動(dòng)物腹腔注射8萬單位的青霉素鈉預(yù)防細(xì)菌感染，并送至溫度為22℃±1℃的動(dòng)物房飼養(yǎng)，觀察。術(shù)后30 d進(jìn)行水迷宮篩選，成模率為75%。將造模成功的大鼠按數(shù)字表法完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為 4 組:模型組，17.5、35.0 和 70.0 mg/kg SSF 3個(gè)劑量給藥組，各8只。在手術(shù)第35天開始灌胃給藥，給藥30 d后進(jìn)行水迷宮測(cè)試。連續(xù)給藥38 d直至取材，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試

1.3.1 Morris水迷宮

水迷宮是一直徑為120 cm，高50 cm的不銹鋼圓形水池。迷宮上方裝有攝像頭，并與安裝有處理軟件的電腦相連。人為將水池等分成4個(gè)象限，將一個(gè)直徑10 cm，高30 cm的平臺(tái)放在任意一個(gè)象限正中。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入足量碳素墨水并使水面高于平臺(tái)1.5 cm，水溫控制在23℃ ±1℃。具體測(cè)試方法參照文獻(xiàn)［7］。水迷宮共測(cè)試6 d。

1.3.2 定位航行測(cè)試

定位航行實(shí)驗(yàn)2 d:第1天和第2天(即術(shù)后第65天和第66天)，各組大鼠在術(shù)后第65天即給藥30 d以后，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日2次測(cè)試找到平臺(tái)的游泳路程的平均值作為當(dāng)天大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)，測(cè)試期間繼續(xù)給藥。

1.3.3 空間搜索測(cè)試

空間搜索實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠的記憶保持能力，測(cè)試第3天，即大鼠在術(shù)后第67天(定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后)，將水迷宮中平臺(tái)撤去，任選一個(gè)入水點(diǎn)(近端或者遠(yuǎn)端)將大鼠面向池壁放入水中，記錄各組大鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限的游泳路程和4個(gè)象限總的游泳路程，以2者的比值(即目標(biāo)象限游泳路程百分比)作為當(dāng)天的學(xué)習(xí)成績(jī)，測(cè)試期間繼續(xù)給藥。

1.3.4 再學(xué)習(xí)能力測(cè)試

再學(xué)習(xí)能力測(cè)試3 d:第4天、第5天和第6天，術(shù)后第68天將迷宮中的平臺(tái)移至目標(biāo)象限的對(duì)面，記錄各組大鼠找到平臺(tái)的游泳路程，每日2次測(cè)試找到平臺(tái)的游泳路程的平均值作為當(dāng)天的學(xué)習(xí)成績(jī)。測(cè)試期間繼續(xù)給藥。

1.4 ChAT和一氧化氮合酶蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠海馬細(xì)胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白的表達(dá)。各組大鼠在術(shù)后第72天，末次灌胃給藥60 min后，大鼠乙醚麻醉，斷頭冰上取腦，將右腦用4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，片厚5 μm。免疫組化標(biāo)記采用(streptomycin avidin-biotin-peroxidase complex，SABC)法測(cè)定海馬細(xì)胞中ChAT、nNOS、iNOS和 eNOS蛋白的表達(dá)情況，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，每組大鼠選6張切片，每張切片按數(shù)字表法隨機(jī)采集6個(gè)視野，應(yīng)用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以陽性細(xì)胞面積與視場(chǎng)面積比值的平均值來表示各組陽性表達(dá)信號(hào)的強(qiáng)弱。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，水迷宮數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA進(jìn)行處理，其他數(shù)據(jù)組間多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠Morris操作的影響

2.1.1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠2 d找到平臺(tái)的游泳路程分別延長(zhǎng)100.28%(P=0.001)和115.46%(P=0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SSF 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg 治療組與模型組相比均可顯著縮短，大鼠找到平臺(tái)的游泳路程差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.1.2 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響

圖1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠在Morris水迷宮操作中定向航行實(shí)驗(yàn)和再學(xué)習(xí)能力的影響Fig.1 Effects of SSF on directional sailing and relearning ability in chronic cerebral ischemia rats with Morris water maze task

空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠在60 s內(nèi)目標(biāo)象限游泳路程的百分比顯著減少了49.40%(P=0.001);而 SSF 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg灌胃給藥30 d能使慢性腦缺血大鼠在目標(biāo)象限游泳路程的百分比分別增加了21.44%(P=0.043)、52.23%(P=0.001)和 62.43%(P=0.001)。而且從游泳軌跡上可以看出，SSF17.5、35.0 和 70.0 mg/kg灌胃給藥30 d后能明顯增加慢性腦缺血大鼠在目標(biāo)象限的游泳路程和穿越平臺(tái)的次數(shù)(圖2)。

2.1.3 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠再學(xué)習(xí)能力的影響

在3 d的再學(xué)習(xí)能力實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)相比，模型組大鼠找到平臺(tái)的游泳路程顯著延長(zhǎng)，分別延長(zhǎng)了73.30%(P=0.001)、125.49%(P=0.001)和129.30%(P=0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SSF 17.5、35.0 和70.0 mg/kg灌胃給藥 30 d 均可明顯縮短大鼠找到平臺(tái)的游泳路程且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.2 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中ChAT蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬細(xì)胞中ChAT蛋白表達(dá)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬中ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量減少了162.56%(P=0.001);而 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg SSF 治療38 d能不同程度的增加模型組大鼠海馬細(xì)胞中ChAT蛋白的表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜均著黃褐色。3個(gè)劑量的藥物使海馬細(xì)胞中ChAT免疫陽性細(xì)胞表達(dá)分別增加了46.25%(17.5 mg/kg SSF，P=0.028)、70.60%(35 mg/kg SSF，P=0.002)和 124.67%(70 mg/kg SSF，P=0.001)(圖3，表1)。

2.3 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)的影響

表1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)的影響Tab.1 Effects of SSF on ChAT，nNOS，iNOS，eNOS expression of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats()(n=6)

表1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)的影響Tab.1 Effects of SSF on ChAT，nNOS，iNOS，eNOS expression of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats()(n=6)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs sham-operated group;* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs model group;SSF:flavonoids from stem and leaf of scutellaria baicalensis georgi;ChAT:choline acetyltransferase;nNOS:neuronal nitric oxide synthase;iNOS:inducible nitric oxide synthase;eNOS:endothelial nitric oxide synthase.

ChAT nNOS iNOS eNOS Sham － 0.050 ±0.008 0.020 ±0.006 0.022 ±0.010 0 Group Dose/(mg·kg－1).081 ±0.016 Model － 0.019 ±0.005## 0.050 ±0.010## 0.090 ±0.016## 0.017 ±0.006##SSF 17.5 0.028 ±0.002* 0.038 ±0.008* 0.073 ±0.013* 0.033 ±0.012*35 0.032 ±0.005＊＊ 0.032 ±0.006＊＊ 0.041 ±0.009＊＊ 0.040 ±0.014＊＊70 0.043 ±0.010＊＊ 0.024 ±0.006＊＊ 0.028 ±0.008＊＊ 0.069 ±0.015＊＊

免疫組化檢測(cè)大鼠海馬細(xì)胞中nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬細(xì)胞中nNOS和iNOS免疫陽性表達(dá)明顯增加，細(xì)胞胞體棕色顆粒較多;eNOS免疫陽性細(xì)胞明顯減少。而17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療38 d 能不同程度的降低模型組大鼠海馬細(xì)胞中nNOS和iNOS蛋白的表達(dá)，增加模型組大鼠海馬細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá)，3個(gè)劑量的藥物使海馬細(xì)胞中nNOS和iNOS免疫陽性細(xì)胞表達(dá)分別減少了22.69%，19.45%(17.5 mg/kg SSF)、35.75%，54.90%(35 mg/kg SSF)和52.03%，68.85%(70 mg/kg SSF);eNOS 免疫陽性細(xì)胞表達(dá)分別增加了 92.47%(17.5 mg/kg SSF)、136.91%(35 mg/kg SSF)和 305.59%(70 mg/kg SSF)(圖4～6，表1)。

圖4 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)nNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Photomicrograph of nNOS immunostainning of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats(DAB stain 400×)

3 討論

慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，臨床上主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶及空間辨別能力明顯下降。利用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎模型，模擬慢性腦低灌注狀態(tài)，可以部分復(fù)制臨床慢性腦缺血，是目前普遍認(rèn)同的用于慢性腦低灌注研究的動(dòng)物模型［8］。陳濤等［9］用 Morris水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血8周后，與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有損害，逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，定位能力欠佳，穿越目標(biāo)平臺(tái)的次數(shù)減少，差異顯著。學(xué)習(xí)和記憶功能包括3個(gè)基本過程，記憶獲得、記憶鞏固和記憶保持。本實(shí)驗(yàn)利用Morris水迷宮，主要通過定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的空間記憶獲得的能力、空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)記憶保持能力以及再學(xué)習(xí)能力測(cè)試檢測(cè)各組大鼠的再學(xué)習(xí)能力，全面地評(píng)價(jià)了大鼠的認(rèn)知功能。檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠找到平臺(tái)的游泳路程顯著延長(zhǎng)，而 17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療組大鼠在這6 d的測(cè)試中找到平臺(tái)的游泳路程與模型組相比均明顯縮短，并且在探索實(shí)驗(yàn)中SSF高、中、低3個(gè)劑量均能明顯增加慢性腦缺血大鼠在目標(biāo)象限的游泳路程百分比和穿越平臺(tái)的次數(shù)。表明SSF能夠提高腦缺血?jiǎng)游锏膶W(xué)習(xí)記憶能力，明顯改善慢性腦缺血造成的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降。

膽堿能系統(tǒng)與記憶的形成和貯存密切相關(guān)。ChAT免疫組織化學(xué)［10］表明海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少，與大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙程度呈正相關(guān)。大鼠缺血再灌后腦內(nèi)乙酰膽堿濃度下降，同時(shí)給予擬膽堿能藥物能改善學(xué)習(xí)記憶功能［11］。因此，血管性癡呆的記憶功能障礙與中樞膽堿能系統(tǒng)有著必然的聯(lián)系。已有證據(jù)［12］表明，海馬是參與學(xué)習(xí)和記憶功能的重要部位，且與海馬膽堿能系統(tǒng)直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎2個(gè)月后，模型組大鼠海馬細(xì)胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，而17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療38 d能不同程度的增加大鼠海馬細(xì)胞中ChAT蛋白的表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜均著黃褐色。綜上所述，海馬細(xì)胞中ChAT蛋白表達(dá)下降參與了腦缺血的損傷過程，SSF通過提高海馬細(xì)胞中ChAT蛋白的表達(dá)，改善了腦缺血大鼠的膽堿能系統(tǒng)功能，進(jìn)而改善了其學(xué)習(xí)記憶能力。

目前認(rèn)為腦缺血后大量一氧化氮(nitric oxide，NO)產(chǎn)生，能破壞膽堿能神經(jīng)元，使額葉、海馬等腦區(qū)神經(jīng)元受損，最終出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙和癡呆等病癥。在腦缺血的各個(gè)階段NO的產(chǎn)生均有所增加，過多NO與過氧化物反應(yīng)生成過硝酸鹽，造成蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)膜損傷，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。在正常情況下，NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要有調(diào)節(jié)腦血流量、抗血小板和白細(xì)胞聚集黏附和參與神經(jīng)突觸的信息傳遞等生物學(xué)作用。但是在病理情況下，過量NO則表現(xiàn)出毒性作用［13］。NOS是NO合成最關(guān)鍵的限速酶，其含量及活性的變化直接影響NO的生成量。目前已確定的NOS有3種亞型:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)。eNOS和nNOS合稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。cNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是基本表達(dá)形式，而 iNOS是病理狀況下非正常表達(dá)［14］。nNOS主要在神經(jīng)元中表達(dá)，調(diào)節(jié)突觸可塑性，介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腦缺血后的神經(jīng)毒性作用。eNOS主要分布在腦血管組織，也分布于支氣管內(nèi)皮、小靜脈、毛細(xì)血管以及心臟微血管內(nèi)皮中，eNOS是細(xì)胞的正常成分。iNOS主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。腦缺血后，缺血區(qū)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，這些炎性反應(yīng)細(xì)胞及受損細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的iNOS，造成NO的大量持續(xù)的釋放，參與缺血后的神經(jīng)毒性作用，加重腦損傷［15］。本實(shí)驗(yàn)就SSF對(duì)慢性腦缺血后不同類型的NOS蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦缺血模型組大鼠海馬細(xì)胞中nNOS和iNOS免疫陽性表達(dá)明顯增加;eNOS免疫陽性細(xì)胞明顯減少，17.5和70.0 mg/kg SSF治療38 d能不同程度的改善模型組大鼠海馬細(xì)胞中NOS蛋白表達(dá)紊亂的現(xiàn)象。

綜上所述，SSF可以顯著縮短腦缺血模型組大鼠找到平臺(tái)的游泳路程;增加腦組織中ChAT蛋白的表達(dá)，提高膽堿能神經(jīng)元活性，改善記憶障礙;減少nNOS和iNOS蛋白的表達(dá)，增加eNOS蛋白的表達(dá)，減輕NO氧化帶來的損傷，從而對(duì)慢性腦缺血學(xué)習(xí)記憶障礙起到改善作用。

［1］張崗，王發(fā)渭.血管性癡呆的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(7):734-736.

［2］崔海月，王慶國(guó).缺血性腦血管病發(fā)病機(jī)制的新進(jìn)展［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(2):291-292.

［3］李素婷，石艷華，楊鶴梅，等.黃芩莖葉總黃酮對(duì)肝臟MDA生成的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2001，8(6):23-24.

［4］商亞珍，孟艷彬，繆紅，等.SSF抗小鼠腦缺氧作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2002，9(6):24-25.

［5］Shang Y Z，Gong M Y，Zhou X X，et al.Improving effects of SSF on memory deficits and pathological changes of neural and immunological systems in senescent mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2001，22(12):1078-1083.

［6］商亞珍，蘇丙凡，王永利.黃芩根及其莖葉成分的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，2(22):153-155.

［7］Yu J，Liu C，Zhang X，et al.Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats［J］.Physiol Behav，2005，86(4):434-441.

［8］Sarti C，Pantoni L，Bartolini L，et al.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion:what can be learned from experimental models［J］.J Neurol Sci，2002，203-204:263-266.

［9］陳濤，章軍建，余芬，等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)慢性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，27(2):225-228.

［10］范文輝，劉之榮，李露斯.血管性癡呆的動(dòng)物模型及其膽堿能機(jī)制研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(4):314.

［11］Scremin O U，Jenden D J.Time-dependent changes in cerebral choline and acetylcholine induced by transient global ischemia in rats［J］.Stroke，1991，22(5):643-647.

［12］苗建亭，游國(guó)雄，王者晉.血管性癡呆大鼠記憶障礙與海馬膽堿能神經(jīng)元關(guān)系的研究［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，1997，16(6):327-330.

［13］張洪，慕容慎行.一氧化氮與神經(jīng)系統(tǒng)疾病［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2000，13(2):124-126.

［14］de Leeuw F E，de Groot J C，Achten E，et al.Prevalence of cerebral white matter lesions in elderly people:a population based magnetic resonance imaging study.The Rotterdam Scan study［J］.J Neurosurg Psychiatry，2001，70(1):9-14.

［15］趙洪芹，潘旭東.一氧化氮合酶與腦缺血關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，36(2):153-154.