PGN對BV2細胞內吞Aβ寡聚體的影響

姜 新 相榮才 白麗娟 張賀敏 陳曉虹 馬恩龍

(1.遼寧省人民醫院神經內科，沈陽 110016;2.中國醫科大學基礎部生物物理教研室，沈陽 110012;3.沈陽藥科大學藥學院藥理教研室，沈陽 110016)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，是一種神經系統變性疾病，病理特征為細胞內神經纏結及細胞外老年斑。老年斑是局灶性炎性反應，炎性反應局灶被小膠質細胞包圍及浸潤。AD病人中激活的小膠質細胞被認為是前炎介質及神經毒性物質的主要產生者［1］。β 淀粉樣蛋白(amyloid protein β)級聯學說是目前學者比較認同的學說之一。據報道［1］，Aβ1-42可通過幾個細胞表面受體與小膠質細胞相互作用，因此可能參與AD腦中小膠質細胞損傷環路［2-3］。小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞之一，在許多疾病，如腦缺血、炎性反應、外傷、脫髓鞘中起重要作用。小膠質細胞在AD中的作用是保護還是加重損傷尚有爭論。本研究用一種前炎介質肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作用于Aβ寡聚體處理的BV2細胞(代替小膠質細胞)，探討PGN對BV2細胞內吞Aβ寡聚體的影響及其機制的探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1)BV2細胞株:購自中國科學院細胞生物研究所，細胞株來源于德國DSMZ(German collection of microorganisms and cell cultures)，采集于小鼠腦小膠質細胞瘤。

2)主要試劑:胎牛血清、DMEM培養基、無酚紅F12培養液(Gibco公司);Aβ1-42、六氟丙醇(Hexafluoro isopropyl，HFIP)，(Sigma公司)、PGN(美國 Sigma 公司);SB202190(Alexis公司);W peptide(Innovagen公司);抗-Aβ1-42抗體、FITC-抗兔抗體(武漢博士德公司);BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierca公司);抗p-p38 MAPK抗體抗、p38 MAPK抗體(北京友誼中聯生物科技有限公司);mFPR2 mRNA及鼠-actin mRNA RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1)BV2細胞培養:BV2細胞置于DMEM培養液(含10%胎牛血清)中，37℃ 5%CO2及飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，隔天換液，待單層培養細胞生長至80%匯合后傳代培養。實驗前1 d將BV2細胞以1×104/孔種植于24孔培養板中。

2)Aβ1-42寡聚體的制備:按 Klein WL(2002)方法［4］制備 Aβ1-42寡聚體，22.2 μL 冷卻的 HFIP+1 mg Aβ1-42室溫孵育60 min，將肽-HFIP溶液放置冰上10 min后，使HFIP在室溫下揮發、過夜。真空冷凍干燥機60 min，除去所有HFIP，分裝后于－80℃保存。冰上制作5 mmol/L Aβ/100%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO):4.44 μL 新鮮脫水 DMSO+0.1 mg 多肽。加439.56 μL無酚紅F12培養液稀釋至終濃度為50 μmol/L，4 ℃孵育24 h。4 ℃ 14 000 r/min離心10 min，轉移上清至新管，即為寡聚體。

3)分組:① 檢測BV2細胞內吞Aβ:A組為BV2組，未加任何物質;B組為PGN+BV2組，加入PGN(20 mg/L);C 組為 Aβ +BV2，加入 Aβ(0.5 μmol/L);D 組為PGN+Aβ+BV2，加入PGN(20 mg/L)孵育24 h再加入 Aβ(0.5 μmol/L);E 組為 Aβ +BV2+W peptide，加入 W peptide(1 μmol/L)孵育 1 h，再加入 Aβ(0.5 μmol/L);F 組為 PGN+Aβ +BV2+W peptide，加入PGN(20 μg/mL)，孵育 24 h 后，再加 W peptide(1 μmol/L)孵育1 h 后，加入 Aβ(0.5 μmol/L)，上述各組均孵育24 h，觀察BV2細胞。② 檢測BV2細胞pp38MAPK、p38MAPK:PGN 20 mg/L分別加入BV2細胞培養基中，分別孵育 5、15、30、60、120 min。③ 檢測BV2 細胞 mFPR2 mRNA:PGN(0、1、3、5、10、20 mg/L)分別加入BV2細胞培養基中，孵育24 h。PGN(20 mg/L)加入 BV2 細胞培養基中，分別孵育 0、3、6、12、18、24 h。SB202190(0、1、10、20、30 μmol/L)分別加入 BV2 細胞培養基中，孵育1 h，再分別加入PGN20 mg/L孵育24 h，對照組未加任何試劑。

4)免疫熒光染色鑒定BV2細胞內吞Aβ的量:細胞棄去上清后，以4%多聚甲醛室溫孵育20 min;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;以含5%羊血清，0.05%Tween 20的0.1 mol/L PBS室溫孵育1 h;加入兔抗鼠Aβ1-42(1∶200稀釋于5%羊血清中)室溫孵育1 h;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;FITC-抗兔 IgG抗體(1∶500稀釋于1%牛血清的Tris-buffered液中)室溫孵育1 h;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;碘化丙啶染色室溫20 min;75%中性緩沖甘油封片，熒光顯微鏡鏡下觀察，FITC 488 nm，碘化丙啶561 nm。BV2細胞顯紅色，Aβ1-42顯綠色。Aβ1-42計數:免疫熒光顯微鏡鏡下觀察，24孔培養板上每孔隨機選取10個視野，進行Aβ1-42及BV2細胞計數，每孔Aβ1-42占BV2細胞的百分比數，最后進行統計學處理。

5)Western blotting方法檢測各組BV2細胞pp38MAPK、p38MAPK蛋白表達情況:①樣品的制備:將蛋白裂解緩沖液(預冷至0℃)加入A組各時間段BV2細胞中，靜置20 min;用細胞刮棒收集細胞，連同裂解緩沖液一起轉移至經過冷卻的微量離心管中;于4℃以12 000 r/min離心2 min;將上清液轉移至另一個微量離心管中，保存于－80℃待用。② 蛋白定量分析(bicinchonic acid asay，BCA法):按照試劑盒說明書進行，A、B、C 試劑按照 50∶50∶2 比例混合后配制為工作液。梯度稀釋BCA標準品，分別吸取待測樣品及梯度蛋白到微孔板對應孔中，稀釋混勻后在37℃孵育30 min。以96孔酶標儀于570 nm處檢測OD值，經數據處理后得出各樣本蛋白濃度。③蛋白質印跡(Western blotting)分析:制備凝膠按比例配制分離膠及濃縮膠，插入梳子;將玻璃板電泳槽中，加入1×甘氨酸-Tris電泳緩沖液;用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致:2 g/L;用微量進樣器逐個點樣，每孔加樣25 μL樣本，同時點預染蛋白相對分子質量標準(marker);電泳，濃縮膠80 V，分離膠120 V。電泳直至溴酚蘭達到分離膠底部，終止電泳。將膠取出，切去膠左上角，作為標記;轉膜:膠與在預冷的轉印緩沖液中與預濕過的膜、濾紙，按陰極-濾紙-凝膠-膜-濾紙-陽極順序組裝，使用Bio-Rad半干轉印系統于4℃ 50 V、30 mA轉移2 h;檢測:取出膜，封閉1～2 h，封閉液為5%脫脂奶粉。用洗膜溶液略洗一下，在室溫下將p-p38MAPK、p38MAPK一抗分別以1∶1 000稀釋于封閉緩沖液中，4℃過夜。漂洗后，室溫下將二抗按1∶4 000比例稀釋，孵育60 min;化學發光顯色，計算機掃描分析。

6)PCR方法檢測各組BV2細胞mFpr2 mRNA:(1)RNA的提取:吸凈培養液，將1 mL Trizol加入培養板，緩慢搖動，室溫放置5 min，反復吹吸幾次收集。轉移至 1.5 mL Eppendoff管中，1 mL/次。去蛋白、去DNA:加入0.2 mL三氯甲烷，用力振搖45 s;室溫放置2～3 min;4℃，15 000 r/min離心3 min;轉移上層水相(約0.6 mL)至1.5 mL 管中。RNA 沉淀:加入 0.6 mL異丙醇，混勻;室溫放置10 min;4℃，15 000 r/min離心5 min;棄上清，沉淀以1 mL 75%乙醇洗滌;4℃，15 000 r/min離心1 min;沉淀于室溫晾干(約5～10 min)。溶解 RNA:以20 μL 0.1%的 DEPC 水溶解;取1～3 μL 稀釋 200 μL，測定 OD260及 OD280;計算 RNA量。(2)RT-PCR:① PCR引物序列:BDNF(268 bp)上游:5'-TCTACCATCTCCAGAGTTCTGTTGG-3'，下游:5'-TACATCTACCACAATGTGAACTA-3';β-actin(514 bp)上游:5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCA-3'，下游:5'-TTTGATGTGACGCACGATTTCCC-3'。②反轉錄合成 cDNA:反應體系如下:MgCl2(2 μL)、10 × RT buffer(1 μL)、RNase free dH2O(3.75 μL)、dNTP Mixture(各 10 mmol/L)(1 μL)、RNase inhibitor(0.25 μL)、AMV reverse transcriptase(0.5 μL)、Random 9 mers(0.5 μL)、Positive Control RNA(1 μg)，混勻快速離心1次，反應條件如下:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃5 min，5℃ 5 min，反應結束后于－20℃ 冰箱凍存30 min。③ PCR 反應:模板 cDNA(2.5 μL)、5 × PCR Buffer(2.5 μL)、滅菌蒸餾水(7.2 μL)、聚合酶 Ex Taq HS(0.1 μL)、上游引物 (0.1 μL)、下游引物(0.1 μL)Total(12.5 μL)混勻快速離心 1 次，反應條件:94 ℃，2 min。1 循環;94 ℃，40 s，62、60、60、57℃，40 s、72 ℃，1 min，30 循環;72 ℃，5 min 1 循環。(3)RT-PCR產物電泳及定量分析:制備瓊脂糖凝膠:1.5%瓊脂糖，用1×TAE緩沖液溶解，置微波爐加熱至完全熔化，取出搖勻，稍冷卻后加0.5 mg/L EB(溴化乙錠)染色液，搖勻。灌膠:將冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入電泳內槽，直至所需厚度。加入1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒過凝膠表面即可。加樣:取PCR產物8 μL，加5×Loading buffer 2 μL，加入凝膠的點樣孔。(4)電泳:以100 V電壓電泳1 h。泳畢，溴化乙錠染色，在紫外投射燈下觀察結果，凝膠成像儀成像并進行圖像分析。記錄每條擴增帶的灰度值，將每一個目的擴增片斷的吸光度值與相應的內對照β-actin擴增片斷吸光度值的比值作為所測指標的半定量指標。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 10.0統計分析軟件。試驗數據處理以均數±標準差()表示。應用單因素方差分析及檢驗判斷結果，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 PGN對BV2細胞內吞Aβ的影響

BV2細胞熒光染色:BV2細胞呈紅色，Aβ1-42寡聚體呈綠色(圖1)，圖2顯示PGN激活BV2細胞內吞Aβ1-42寡聚體增多，且BV2細胞內吞Aβ1-42寡聚體與mFPR2表達有關。PGN+Aβ+BV2與 Aβ+BV2相比，BV2細胞內吞Aβ量明顯增多(P＜0.01);W-peptide+PGN+Aβ+BV2與PGN+Aβ+BV2相比，BV2細胞內吞Aβ量明顯減少(P＜0.01)，而W-peptide+PGN+Aβ+BV2與Aβ+BV2+W-peptide相比(P＞0.05)，提示 PGN激活 BV2細胞內吞 Aβ增多，W-peptide(mFPR2拮抗劑)抑制BV2細胞內吞Aβ，可能與mFPR2表達增多有關。

圖1 熒光顯微鏡:BV2細胞熒光染色呈紅色，Aβ1-42寡聚體呈綠色Fig.1 Under the fluorescence microscope，BV2 cells presented red color，and Aβ oligomers presented green color(200×)

圖2 PGN對BV2細胞內吞Aβ的影響Fig.2 The influence of PGN on BV2 cells after endocytosis of Aβ

2.2 PGN引起 BV2細胞的 mFPR2 mRNA表達情況

經PGN處理后BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多(圖3)。并且隨著PGN濃度增加，mFPR2 mRNA表達也增加。計算 mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定不同濃度PGN處理BV2細胞的mFPR2 mRNA程度，結果如圖4表明，PGN可引起BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多，濃度超過10 mg/L時，差異具有統計學意義(P＜0.01)。經PGN 20 mg/L處理后BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多，并且隨著PGN時間增加，mFPR2 mRNA表達也增加(圖7)。計算mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定不同時間PGN處理BV2細胞的mFPR2 mRNA程度，結果如圖6表明，PGN可引起BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多，存在時間依賴關系，12 h時mFPR2 mRNA表達最多，在6 h(P ＜0.05)、12、18、24 h 分別比對照組明顯增多(P ＜0.01)。

2.3 SB202190對 PGN引起 BV2細胞的 mFPR2 mRNA表達影響情況

PGN可引起BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多，可被 SB202190-p38MAPK抑制劑抑制，且隨著SB202190濃度增加，抑制程度增加(圖7)。計算mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定 mFPR2 mRNA表達程度，結果如圖8表明，各組濃度與0 μmol/L相比，明顯抑制，1 μmol/L 組 P ＜ 0.05，10、20、30 μmol/L組均 P ＜0.01。

2.4 PGN對 BV2細胞 p-p38MAPK蛋白表達的影響

經PGN20 mg/L作用 BV2細胞后，以 Western blotting檢測磷酸化 p38MAPK(p-p38MAPK)、總p38MAPK，可見在15 min時磷酸化p38MAPK表達量最高，依次在 30 min，隨著時間延長，磷酸化p38MAPK表達量逐漸下降，而總p38MAPK表達量未見明顯差異(圖9)。計算各時間點磷酸化p38MAPK與總p38MAPK比值以確定p38MAPK激活程度，結果如圖10表明，PGN作用 BV2細胞后各時間點p38MAPK的磷酸化激活程度同對照組相比有明顯差異(P＜0.01)，提示PGN激活BV2細胞有 MAPK信號通路參與。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是神經變性疾病，病理方面存在3大特征:大腦皮質及海馬區的 β 淀粉樣蛋白(amyloid β-peptid，Aβ)在胞外沉積并形成老年斑(senile plaque，SP)、神經細胞內tau蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)、神經元突觸功能異常及膽堿能神經細胞丟失［5-7］。

根據β淀粉樣蛋白級聯學說［8］，Aβ產生和清除之間的平衡逐漸改變，聚集態的Aβ累積引發連串的復雜反應，Aβ產生增多是AD發生發展的關鍵。β淀粉樣蛋白(Aβ)基本結構中都含40或42個氨基酸多肽。Aβ毒性，以前認為只有可溶性Aβ聚集成不可溶性Aβ纖絲時才具有強毒性［9］。近期大量研究［10-11］表明不僅聚集態的Aβ具有神經毒性，且是導致其他病理變化出現的主要原因。所以近年國外學者［12］經常采用一種由Aβ聚集成的無纖維結構的，其內包含大量的球形聚集體的彌散性Aβ聚集體ADDLs，來研究Aβ的神經毒性，因制備比較麻煩，國內應用尚少。

小膠質細胞是中樞神經系統(central nervous system，CNS)內主要的免疫細胞之一，在一定的病理條件下可被激活，一方面通過吞噬腦組織中的病原體、有害顆粒及死亡神經細胞殘骸和變性的突觸，以及分泌神經營養因子，對神經元起保護作用［13-16］:而另一方面通過釋放和/或分泌一系列潛在的神經毒性物質和炎性介質，對神經元產生毒性作用［17-23］。小膠質細胞幾乎參與所有CNS疾病的發生和發展過程如腦缺血、炎性反應、變性病等。在AD中，小膠質細胞的作用也一樣很有爭議。

Aβ1-42可通過幾個細胞表面受體與小膠質細胞相互作用［1］，這些受體中G蛋白偶聯人的FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)和他的鼠同系物mFPR2能介導Aβ1-42對髓細胞系(包括小膠質細胞)的化學活性，因此可能參與AD腦中小膠質細胞損傷環路［2-3］。在人巨噬細胞，FPRL1對Aβ1-42內吞攝取至關重要，也是Aβ1-42聚集及降解的重要過程［1-3，24-27］。總之，FPRL1在AD的炎性反應性斑塊及神經變性中起重要作用。

在大鼠小膠質細胞FPRL1鼠同系物mFPR2的表達由前炎刺激物調節產生的，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激大鼠小膠質細胞的mFPR2水平明顯增多，表明微生物感染及前炎性重壓通過上調小膠質細胞mFPR2水平影響 AD的發病過程［28-29］。LPS通過與TLR4(toll-like receptor 4)結合激活小膠質細胞。肽聚糖是源于革蘭陽性細菌金黃色葡萄球菌的細胞壁的一種特殊多聚體，也是一種前炎刺激物，它是僅知包含D-氨基酸的生物分子，是眾多抗生素抗體的靶目標。對外源性病原入侵能做出初步免疫識別也是基于此共同結構。PGN與LPS、TNF、肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)都能引起免疫反應［30-31］。PGN 與 TLR2(toll-like receptor 2)結合激活小膠質細胞［32］，參與免疫活動。

MAPK，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究［33］證實，MAPKs信號轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增生、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用?？杀粦ご碳?如紫外線、熱休克、高滲刺激及蛋白合成抑制劑等)、細胞因子(TNFα，IL-1)、生長因子(NGF)及某些G蛋白偶聯的受體激活。

BV2細胞來源于鼠小膠質細胞瘤，已經廣泛被應用來代替小膠質細胞進行研究。本研究選用PGN作為前炎刺激物，作用于BV2細胞及經Aβ1-42寡聚體處理的BV2細胞，探討PGN對BV2細胞的影響及PGN引起BV2細胞對Aβ1-42寡聚體的影響。

本研究發現，經PGN處理后的BV2細胞內吞Aβ比未經PGN處理后的BV2細胞內吞Aβ明顯增多(P＜0.01)，提示 PGN激活BV2細胞內吞Aβ增多，說明PGN作為前炎刺激物通過與TLR2(Toll-like Receptor 2)結合激活BV2細胞［32］，增加其吞噬功能，參與免疫活動。

PGN通過什么機制激活BV2細胞?許多前炎刺激物可通過G蛋白偶聯人的FPRL1和他的鼠同系物mFPR2能介導Aβ1-42對髓細胞系(包括小膠質細胞)的化學活性，PGN是否也通過mFPR2來激活BV2細胞的呢?我們用PGN處理后的BV2細胞后檢測mFPR2mRNA的表達，發現BV2細胞表達mFPR2 mRNA明顯增多，并且隨著PGN濃度增加，mFPR2 mRNA表達也增加。經PGN 20 mg/L處理后BV2細胞表達mFPR2 mRNA增多，并且隨著PGN時間增加，mFPR2 mRNA表達也增加。從而證實PGN(TLR2激動劑)激活TLR2促進BV2細胞 G蛋白偶聯mFPR2的表達。很多研究［33］顯示在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增生、分化、轉化及凋亡等)的過程中通過MAPKs信號轉導通路。

此過程是否通過MAPKs信號轉導通路呢?本研究用SB202190(p38MAPK抑制劑)預先處理BV2細胞再加入PGN，結果發現加入SB202190后PGN引起BV2細胞表達mFPR2 mRNA減少，隨著SB202190濃度增加，逐漸減少(P＜0.01)。提示PGN(TLR2激動劑)激活TLR2促進BV2細胞 G蛋白偶聯mFPR2的表達，通過MAPKs信號轉導通路。

PGN激活BV2細胞內吞Aβ明顯增多與BV2細胞G蛋白偶聯mFPR2的表達增多是否有關?本研究證實PGN誘導BV2細胞的mFPR2的表達與BV2細胞內吞Aβ明顯增多有關。說明TLR2促進小膠質細胞與Aβ1-42相互反應通過G蛋白偶聯mFPR2的誘導是AD關鍵的病理機制，與文獻［34］報道 TLR2是Aβ1-42激活小膠質細胞關鍵受體相似。

除本實驗證實MAPKs信號轉導通路外，最近發現PGN還可通過多個通路誘導多種致炎細胞因子的表達［35-36］，因此由PGN激活小膠質細胞介導細胞內吞Aβ1-42增加通過mFPR2表達可能有重要病理生理意義，為AD發病機制提供一定基礎研究證據。

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