6-OHDA誘導過表達nurr1基因的SK-N-SH細胞凋亡

劉 揚 趙詠梅 張海燕 李衛紅 岳 云*

(1.首都醫科大學北京朝陽醫院麻醉科，北京 100020;2.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，教育部神經變性病重點實驗室，北京 100053;3.首都醫科大學細胞生物學教研室，北京 100069)

核相關受體因子(nuclear receptor related factor1，Nurr1)屬于類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員，是未知配體的孤兒核受體，作為核轉錄因子，與神經前體細胞向多巴胺(dopamine，DA)能神經元方向分化、成熟密切相關［1］。在nurr1高表達的中腦黑質致密部，DA能神經元的退行性變性和丟失是帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病理特征［2］，但這種選擇性損傷DA能神經元的病因和發病機制目前尚不清楚。動物實驗［3］發現，敲除nurr1基因的小鼠只在黑質紋狀體和腹側被蓋處不能形成DA能神經元，并伴隨DA濃度明顯下降，這與PD的病理特征極其相似;對PD患者的調查研究［4］證實了家族性PD患者的nurr1基因存在2個異體突變位點。由此推論，nurr1基因的功能可能與PD患者中腦DA能神經元損傷易感性相關，具體機制尚不明確。

PD患者的中腦黑質致密部DA能神經元病理變化可能存在一條共同的通路，即細胞凋亡。Hartmann A等［5］在PD死亡患者中發現中腦黑質DA能神經元的凋亡特征性改變，并檢測到細胞缺失與凋亡起始因子Caspase-3的表達密切相關。細胞凋亡可能是引起PD患者黑質中DA能神經元死亡和丟失的直接原因。

本研究小組已經證明過表達外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細胞對6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷敏感性增強［6］。本實驗通過觀察6-OHDA作用于Nurr1+/－細胞株后，比較超微結構以及凋亡因子Caspase-3表達的變化，研究SK-NSH/Nurr1細胞損傷是否通過細胞凋亡途徑，以明確Nurr1基因在SK-N-SH/Nurr1細胞對6-OHDA損傷易感性中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1)細胞株:人神經母細胞瘤株SK-N-SH細胞由首都醫科大學細胞生物教研室提供，SK-N-SH/Nurr1細胞模型由本研究小組將表達nurr1基因的質粒載體pBK-RSV-Nurr1轉染至SK-N-SH細胞后成功建立［7］。簡言之，用脂質體基因轉染法將帶有nurr1基因的載體pBK-RSV-Nurr1轉染至SK-N-SH細胞，經500 mg/L G418篩選。為排除質粒轉染對細胞可能存在的影響，本研究還設立了過表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的 SK-N-SH/EGFP細胞平行對照組。

2)細胞培養試劑:DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。轉染細胞鑒定試劑:Nurr1抗體(Santa Cruz公司);SP免疫組化試劑盒(Zymed Laboratories公司);TRIzol(Gibco公司);RT-PCR第一鏈合成試劑盒(Invitrogen公司);PCR PreMix反應體系(北京賽百盛基因技術有限公司)。藥物實驗試劑:6-OHDA(Sigma公司);Annxin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)。

3)儀器:流式細胞儀(FACSCalibur，BD，USA);透射電鏡(Philips，EM208S，Holand)。

1.2 方法

1)細胞培養:3株細胞用含10%滅活胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素0.1 g/L的DMEM完全培養基，置CO2培養箱，37℃、3.5%CO2條件下培養。細胞每周傳代2次，根據實驗需要將細胞按合適密度接種于培養瓶中。

2)免疫細胞化學染色顯示轉染細胞Nurr1表達:免疫熒光細胞化學染色一抗為Nurr1抗體(1∶1 000)，二抗為熒光素CY3標記的山羊抗小鼠抗體(1∶200)。免疫細胞化學染色按SP試劑盒說明書進行，用DAB顯色。

3)RT-PCR鑒定轉染細胞Nurr1 mRNA表達:用TRIzol提取總RNA反轉錄后行PCR。Nurr1及β-actin引物系根據GenBank中相應基因序列自行設計，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:NURR1(299 bp):5'-agtacctttatggacaactacagca-3'和5'-cgtagtggccacgtagttctggt-3';β-actin(540 bp):5'-gtggggcgccccaggcacca-3'和5'-cttccttaatgtcacgcacgatttc-3'。PCR反應條件為:94℃變性5 min后，按94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，擴增28個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳后在紫外燈下觀察、照相。

4)流式細胞術(flow cytometry，FCM)測定細胞早期凋亡比例:向對數生長期的細胞分別加入50、75、100 μmol/L 6-OHDA，對照組更換新鮮培養基。分別在6、12 h后結束孵育，收集細胞1×106，1 000 r/min離心5 min，PBS 洗滌，加入 Binding Buffer 150 μL 和Annexin V-FITC 10 μL，室溫，避光染色 30 min。再加入PI(50 mg/L)5 μL，避光反應5 min后，立即進行FCM(激發/發射488 nm/530 nm和600 nm)檢測早期凋亡。數據采用Cell Quest軟件進行分析。實驗重復檢測4次。

5)透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察細胞超微結構:向對數生長期的細胞加入75 μmol/L 6-OHDA，對照組更換新鮮培養基。孵育12 h后，收集細胞，洗滌，棄上清，放入預冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛前固定液(pH 7.4)，4℃固定2 h。二甲砷酸鈉緩沖液浸洗，1%鋨酸(OSO4)4℃后固定2 h，梯度乙醇脫水，環氧丙烷置換，環氧樹脂Epon812包埋。1 μm厚切片用天青美藍染色作定位，超薄切片經醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛雙重染色，TEM觀察。

6)Western blotting檢測Caspase-3活性前體蛋白表達:細胞接種于25 cm2培養瓶中，培養24 h。向對數生長期的細胞加入含75 μmol/L 6-OHDA的完全培養基，對照組更換新鮮培養基，分別在培養6、12 h后結束孵育，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌。向細胞沉淀中加入細胞裂解液160 μL，超聲破碎，用BCA法測定蛋白質濃度。取30 μg樣品蛋白，煮沸變性，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠，4%聚集膠)分離蛋白質。取出凝膠，400 mA，冰浴中行電轉移3 h。取出硝酸纖維素膜用TBS清洗2次，然后置于封閉液(含10%脫脂奶粉的TTBS)中，室溫下封閉1 h。加入一抗，鼠抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶500，Santa Cruz)，4 ℃ 過夜，洗膜 3 次，每次 10 min。加入HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶4 000)，室溫下孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。按發光試劑盒(PIERCE公司)說明書顯影，用Gel-Doc凝膠成像系統掃描X線，對條帶密度進行半定量分析，分別計算出2株細胞經6-OHDA作用不同時間后Caspase-3活性前體蛋白條帶與各自正常細胞Caspase-3活性前體蛋白條帶的密度比值，得到各實驗組Caspase-3活性前體蛋白表達的百分比。統計學處理后，以6-OHDA作用時間為橫坐標，Caspase-3活性前體蛋白表達百分比為縱坐標繪制統計分析圖。

1.3 統計學方法

采用Sigma plot 10.0統計軟件，數據以均數±標準差()表示。應用Two Way ANOVA析因方差法進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養

SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和 SK-N-SH/EGFP 3株細胞形態無明顯差異，均呈對數方式增生，SK-NSH/Nurr1細胞增生率最低，SK-N-SH和SK-N-SH/EGFP細胞增生率較為接近［6］。

2.2 Nurr1基因轉染細胞的鑒定

免疫細胞化學染色結果顯示SK-N-SH和SK-NSH/EGFP細胞Nurr1抗體染色陰性(圖1A，1B)，而SK-N-SH/Nurr1細胞傳代5次Nurr1抗體染色仍為陽性，其陽性細胞胞核深染，胞質及突起淡染(圖1C)。熒光顯微鏡顯示EGFP在SK-N-SH/EGFP細胞高表達(1D)。以上結果說明已成功建立穩定過表達外源性Nurr1基因的SK-N-SH 細胞模型SK-N-SH/Nurr1，質粒轉染對nurr1檢測無影響。

RT-PCR結果顯示未轉染Nurr1基因的SK-N-SH細胞檢測不到Nurr1 mRNA(圖2A)，而轉染Nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細胞檢測到高水平的NURRr1 mRNA表達(圖2B)。

2.3 過表達nurr1基因促進6-OHDA誘導細胞凋亡比例增加

細胞受到凋亡誘導后不久，磷脂酰絲氨酸(phosphatiylserine，PS)從細胞膜內側轉移到外側，可被熒光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)標記的鈣依賴性磷脂結合蛋白Annexin V特異性地結合［8］。由于PS外露發生早于DNA斷裂，聯合PI法進行FCM檢測，可區分、定量分析4個細胞亞群，包括Annexin V－/PI－的正常細胞亞群(左下象限);Annexin V+/PI－的早期凋亡細胞亞群(右下象限);Annexin V+/PI+的壞死細胞亞群(右上象限)，其中包括凋亡晚期和壞死細胞，以及Annexin V－/PI+的受損細胞亞群(左上象限)。

FCM檢測結果顯示，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞凋亡或壞死細胞亞群比例均較低(圖3-1A，B)。較小劑量 6-OHDA(50 μmol/L)作用 12 h，2株細胞凋亡和壞死細胞亞群比例均沒有明顯變化(圖3-1C，D)。當6-OHDA 濃度升至75 μmol/L作用12 h后，SK-N-SH細胞正常亞群比例仍然較高，凋亡細胞亞群比例在 6-OHDA處理后為3.1% ±0.5%(圖3-1A，E)，而SK-N-SH/Nurr1細胞凋亡亞群比例由6-OHDA處理前的1.1% ±0.6%升至10.1% ±1.1%(圖3-1B，F)，經統計學分析，2 組細胞凋亡差異顯著(P=0.000)。大劑量 6-OHDA(100 μmol/L)作用6 h后，兩株細胞凋亡亞群比例比起6-OHDA處理前沒有增加(圖3-2A，B)，而2株細胞壞死亞群比例均明顯上升(圖3-2C，D);100 μmol/L 6-OHDA 作用12 h后，SK-N-SH細胞壞死亞群升至18.5% ±1.3%，SK-N-SH/Nurr1細胞壞死亞群升至27.4% ±1.7%，經統計學分析，2株細胞壞死亞群比例差異無統計學意義(P=0.080)，但均較6-OHDA處理前上升顯著，差異有統計學意義(P=0.000)，但2株細胞凋亡亞群比例仍然很低，分別為 1.4% ±0.03%和2.2% ±0.17%，差異無統計學意義(P=0.060)(圖 3-2E，F)。

圖1 免疫組化染色顯示Nurr1抗體在SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和SK-N-SH/EGFP細胞中的表達Fig.1 Immunocytochemical staining results of SK-N-SH，SK-N-SH/Nurr1 and SK-N-SH/EGFP cells with Nurr1 antibody(original magnification 400×)

圖2 RT-PCR法檢測Nurr1 mRNA在SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞中的表達Fig.2 Nurr1 mRNA in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells was detected by RT-PCR analysis

2.4 過表達nurr1基因促進6-OHDA誘導細胞凋亡形態改變

TEM觀察，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞微絨毛豐富，胞膜完整，線粒體較少，內質網表面有多聚核糖體附著，有核異型現象(圖4-1A，B，圖4-2A，B)。75 μmol/L 6-OHDA 作用12 h，SK-N-SH 細胞以壞死為主，表現為細胞體腫脹，胞膜崩解，粗面內質網擴張、脫顆粒，線粒體嵴斷裂、消失或呈空泡化改變，胞質及胞核內電子密度普遍降低，核內染色質溶解，胞質內可見髓樣小體(圖4-1C，D)，而SK-N-SH/Nurr1細胞出現典型的凋亡形態學改變，表現為細胞形態不規則，細胞膜完整，胞質減少，線粒體基本正常，核內染色質凝集成塊狀并有邊集現象，電子密度明顯增加。個別處于凋亡晚期的細胞核可見染色質進一步凝聚，聚集成染色質小塊或呈新月形(圖4-2C，D)。

2.5 6-OHDA誘導SK-N-SH細胞Caspase-3活性前體蛋白激活

Western blotting印跡結果顯示，正常的SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞，在泳道上的32 000處均出現了特異蛋白條帶，肉眼觀察條帶的面積和著色無明顯差別。75 μmol/L 6-OHDA 分別作用6、12 h，SK-N-SH細胞各實驗組在泳道上的32 000處的條帶面積以及著色變化不明顯，說明Caspase-3活性前體蛋白表達基本不變。而 SK-N-SH/Nurr1細胞在75 μmol/L 6-OHDA分別作用6、12 h后，各實驗組泳道上的32 000處的條帶著色隨6-OHDA作用時間延長而逐漸減弱(圖5 A，B)，說明Caspase-3活性前體蛋白表達隨6-OHDA作用時間延長而明顯下降。用Gel Doc凝膠成像系統進行光密度值分析，并經統計學處理，顯示75 μmol/L 6-OHDA 作用 6、12 h，SK-N-SH/Nurr1 細胞Caspase-3活性前體蛋白表達顯著低于SK-N-SH細胞(P=0.010)(圖6)。

圖4-1 75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，經透射電鏡觀察SK-N-SH細胞超微結構Fig.4-1 The ultrastructural changes of SK-N-SH cells were observed by TEM after treatment with 75 μmol/L 6-OHDA for 12 h

3 討論

本研究通過比較人神經母細胞瘤細胞株SK-NSH細胞和過表達外源性 nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細胞對神經毒素6-OHDA損傷的不同反應，研究過表達中腦特異性轉錄因子nurr1基因在6-OHDA選擇性誘導DA能神經元凋亡中的作用。經6-OHDA作用，2株細胞表現出了不同的病理損傷特征，并且具有毒素劑量、作用時間依賴性:細胞超微結構以及AnnexinV/PI雙染聯合FCM檢測均顯示，75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，SK-N-SH/Nurr1細胞凋亡比例顯著上升，而SK-N-SH細胞主要表現為細胞毒性壞死;大劑量6-OHDA(100 μmol/L)作用不同時間，SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞均表現為壞死。可見，6-OHDA誘發SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細胞死亡存在細胞凋亡和壞死兩條不同途徑，在75 μmol/L 6-OHDA作用下，nurr1基因主要激活SK-N-SH/Nurr1細胞凋亡通路，說明6-OHDA的致凋亡作用與細胞種類和劑量相關。體外實驗［9］顯示，6-OHDA能誘導中腦 DA能神經元、兒茶酚胺細胞系PC12細胞及中腦源性DA能細胞系MN9D等細胞凋亡。Walkinshaw G等［10］最早報道低濃度的6-OHDA(≤100 μmol/L)能誘導PC12出現具有明顯生化和形態特征的凋亡，但高濃度的6-OHDA主要誘導細胞毒性損傷，與我們的實驗結論一致。

圖6 75 μmol/L 6-OHDA 分別作用6、12h，SK-N-SH 和SK-N-SH/Nurr1細胞Caspase-3活性前體蛋白表達的變化Fig.6 Comparison of pro-Caspase-3 in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells treated with 75 μmol/L 6-OHDA for 6、12 h

在體外，過表達nurr1基因可促進前體細胞向DA能神經元分化，如在過表達nurr1的成年海馬前體細胞，nurr1可直接與酪氨酸羥化酶 (tyrosine hydroxylase，TH)基因的啟動子結合，在不引起神經元分化的情況下激活th轉錄［11］;若將過表達nurr1的C17.2細胞與腹側中腦來源的Ⅰ型星型膠質細胞共培養，則可誘導大量的 th陽性神經元產生［12］;我們也已經報道［7］，過表達nurr1基因的 SK-N-SH/Nurr1細胞能表達成熟神經元的特異性標識物-微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)，證明外源性nurr1基因過表達可促進SK-N-SH細胞向成熟神經元方向分化。以上研究表明nurr1表達與DA能神經元的表型關系密切，經6-OHDA作用后，DA能神經元死亡形式可能與nurr1基因存在某些關聯。

Nurr1及其相關基因nurr1、nor-1共同組成核受體超家族中的NURR77亞家族，該亞家族成員由即早基因編碼［13］，各種刺激如生長因子、細胞因子、缺血等都能引起這些基因快速短暫的表達上調［14］，參與細胞生存、增生以及凋亡過程。nurr1對凋亡過程的調節還不甚明了，但是nur77調節T細胞和腫瘤細胞凋亡通路研究較為深入［15-17］。nur77可以上調促凋亡基因如Fas配體、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)［18-20］。信號傳導因子JNK的激活以及Akt的抑制可促使nur77由細胞核轉移至細胞質［21］，與線粒體Bcl-2組成凋亡前體復合物刺激凋亡反應［22-23］。此外，PKC的活化可導致nur77表達上調，對T細胞受體信號誘導胸腺細胞凋亡起到重要作用［24］。

研究［25］發現，在PD病人和動物模型的中腦黑質致密部，Caspase-3，作為神經元凋亡的重要調控因子，其前體蛋白被激活的DA能神經元顯著增加。存在急慢性神經退行性疾病的實驗動物，其病理改變檢測到Caspase-3的激活，尤其在使用6-OHDA誘發PD后，Caspase-3前體蛋白激活后誘發凋亡過程。

由此，我們推測作為轉錄因子，nurr1基因可能具有調節不同信號傳導通路的作用，最終是否激活Caspase-3途徑，關系到細胞壞死、凋亡或免受損傷等不同結局，相關分子機制有待進一步研究。

［1］Eells J B.The control of dopamine neuron development，function and survival:insights from transgenic mice and the relevance to human disease［J］.Curr Med Chem，2003，10(10):857-870.

［2］Schapira A H.Pathogenesis of Parkinson’s disease［J］.Baillieres Clin Neurol，1997，6(1):15-36.

［3］Zetterstrom R H，Solomin L，Jansson L，et al.Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice［J］.Science，1997，276(5310):248-250.

［4］Xu P Y，Liang R，Jankovic J，et al.Association of homozygous 7048G7049 variat in the intron six of Nurr1 gene with Parkinson’s dusease［J］.Neurology，2002，58(6):881-884.

［5］Hartmann A，Hunot S，Michel P P，et al.Caspase-3:A vulnerability factor and final effector in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(6):2875-2880.

［6］劉揚，趙詠梅，張海燕，等.外源性Nurr1基因過表達增強SK-N-SH細胞對神經毒素6-OHDA敏感性的研究［J］.中國藥理學通報，2005，21:1171-1176.

［7］趙詠梅，張海燕，劉揚，等.外源性Nurr1基因過表達對SK-N-SH細胞分化作用的研究［J］.神經解剖學雜志，2005，21(1):23-28.

［8］Andree H A，Reutelingsperfger C P，Hauptmann R，et al.Binding of vascular anticoagulant alpha(VAC alpha)to planar phospholipids bilayers［J］.J Biol Chem，1990，265(9):4923-4928.

［9］Lotharius J，Dugan L L，O’Malley K L.Distinct mechanisms underlie neurotoxin-mediated cell death in cultured dopaminergic neurons［J］.J Neurosci，1999，19(4):1284-1293.

［10］Walkinshaw G，Waters C M.Neurotoxin-induced cell death in neuronal PC12 cells is mediated by induction of apoptosis［J］.Neuroscience，1994，63(4):975-987.

［11］Sakurada K，Ohshima-Sakurada M，Palmer T D，et al.Nurr1，an orphan nuclear receptor，is a transcriptional activator of endogenous tyrosine hydroxylase in neural progenitor cells derived from the adult brain［J］.Development，1999，126(18):4017-4026.

［12］Wagner J，Akerud P，Castro D S，et al.Induction of a midbrain dopaminergic phenotype in Nurr1-overexpressing neural stem cells by type 1 astrocytes［J］.Nat Biotechnol，1999，17(7):653-659.

［13］Maruyama K，Tsukada T，Ohkura N，et al.The NGFI-B subfamily of the nuclear receptor superfamily［J］.Int J Oncol，1998，12(6):1237-1243.

［14］Maruyama K，Tsukada T，Bandoh S，et al.Expression of NOR-1 and its closely related members of the steroid/thyroid hormone receptor superfamily in human neuroblastoma cell lines［J］.Cancer Lett，1995，96(1):117-122.

［15］Li Q X，Ke N，Sundaram R，et al.NR4A1，2，3-an orphan nuclear hormone receptor family involved in cell apoptosis and carcinogenesis［J］.Histol Histopathol，2006，21(5):533-540.

［16］Youn H D，Sun L，Prywes R，et al.Apoptosis of T cells mediated by Ca2+-induced release of the transcription factor MEF2［J］.Science，1999，286(5440):790-793.

［17］Wilson A J，Arango D，Mariadason J M，et al.TR3/Nur77 in colon cancer cell apoptosis［J］.Cancer Res，2003，63(17):5401-5407.

［18］Weih F，Ryseck R P，Chen L，et al.Apoptosis of nur77/N10-transgenic thymocytes involves the Fas/Fas ligand pathway［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93(11):5533-5538.

［19］Rajpal A，Cho Y A，Yelent B，et al.Transcriptional activation of known and novel apoptotic pathways by Nur77 orphan steroid receptor［J］.EMBO J，2003，22(24):6526-6536.

［20］Chintharlapalli S，Burghardt R，Papineni S，et al.Activation of Nur77 by selected 1，1-bis(3'-indolyl)-1-(p-substituted phenyl)methanes induces apoptosis through nuclear pathways［J］.J Biol Chem，2005，280(26):24903-24914.

［21］Li H，Kolluri S K，Gu J，et al.Cytochrome c release and apoptosis induced by mitochondrial targeting of nuclear orphan receptor TR3［J］.Science，2000，289(5482):1159-1164.

［22］Lin B，Kolluri S K，Lin F，et al.Conversion of Bcl-2 from protector to killer by interaction with nuclear orphan receptor Nur77/TR3［J］.Cell，2004，116(4):527-540.

［23］Han Y H，Cao X，Lin B，et al.Regulation of Nur77 nuclear export by c-Jun N-terminal kinase and Akt［J］.Oncogene，2006，25(21):2974-2986.

［24］Kim H，Lee J E，Kim B Y，et al.Menin represses JunD transcriptional activity in protein kinase C theta-mediated Nur77 expression［J］.Exp Mol Med，2005，37(5):466-475.

［25］Dodel R C，Du Y，Bales K R，et al.Peptide inhibitors of caspase-3-like proteases attenuate 1-methyl-4-phenylpyridinum-induced toxicity of cultured fetal rat mesencephalic dopamine neurons［J］.Neuroscience，1998，86(3):701-707.