液相色譜法測定小鼠腦組織中ATP、ADP及AMP含量

吳燕川 李堯華 謝勝男 李 昕 于 順 何士大

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中心實驗室，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經生物學研究室，北京 100053)

三磷酸腺苷(adenosine triphosphates，ATP)是生物機體的能量來源，在細胞代謝活動中占有重要地位。腺苷酸指三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphates，ADP)和一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate，AMP)的總稱。腺苷酸(ATP+ADP+AMP)濃度是描述細胞代謝的主要參數，在急性重復低氧小鼠腦組織中，測定腦組織中腺苷酸的含量具有重要意義。高效液相色譜-可變波長檢測法(high performance liquid chromatogram-variable wavelength detector，HPLC-VWD)是目前測定嘌呤、嘧啶復合物含量變化的主要方法之一［1-7］。文獻［1，4-5］報道測定腺苷酸的方法在流動相組成方面存在可優(yōu)化之處，本實驗通過改良的HPLC-VWD方法，測定急性重復低氧暴露小鼠腦組織中的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫公司，美國)，系統(tǒng)組成:G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B可變波長檢測器，Agilent1200工作站。JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(上海新芝生物技術研究所)。

ATP、ADP、AMP標準品均為分析純(Sigma公司，美國)，甲醇為色譜純(Fisher公司)，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸等均為國產分析純。

1.2 色譜條件

SUPELCO Discovery○RC18反相色譜柱(15 mm×4.6 mm，5 μm)及填充材料相同的預柱(12.5 mm ×4.6 mm，5 μm)。流動相:磷酸鹽緩沖液(30 mmol/L，pH 5.85，緩沖對為 K2HPO4-KH2PO4，含 5% 甲醇)，先用 0.45 μm 濾膜過濾，再用 0.22 μm 的濾膜抽濾，現用現配。檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量20 μL;定量方法:采用外標法定量。

1.3 動物模型的制作

選用6～8周BALB/c近交系雄性小鼠，體質量18～22 g，清潔級，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物研究中心〔SCXK-(軍)許可證號:2002-001〕提供。將20只小鼠按照數字表法隨機分成4組，每組5只，分別進行重復低氧暴露 0、1、3、5 次，命名為 H0、H1、H3、H5組。在18℃～20℃條件下將小鼠放入含有新鮮空氣的125 mL廣口瓶中，用橡皮塞塞緊并計時。隨著小鼠的呼吸，氧氣逐漸減少，當小鼠第1次出現哮喘呼吸后，立即結束低氧處理，此為低氧1次(H1組)。將小鼠取出，待小鼠恢復翻正反射后(約需1～3 min)，將其放入一個新的廣口瓶中，塞緊橡皮塞。依此方法，給小鼠連續(xù)缺氧處理5次，記錄每次從密閉開始到喘呼吸出現的時間。該時間稱為小鼠低氧耐受時間。

1.4 重復低氧暴露小鼠腦組織中磷酸腺苷的提取

當小鼠達到缺氧耐受極限時，立即拿出，在冰臺上迅速斷頭取腦并稱質量，按5 μL/mg的比例加入冰預冷的0.4 mol/L高氯酸，于超聲波細胞粉碎機中粉碎、勻漿;4 ℃，10 000×g離心，10 min，2次;取上清液，用5 mol/L的KOH調pH值至6.0～6.5，取上清，用 0.22 μm 濾膜過濾，待測。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析(One-way ANOVA)。組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線、線性關系及檢測限

用超級純凈水將ATP、ADP、AMP的標準品分別配成1 g/L的儲備液，再用超級純凈水稀釋成10、20、40、60、80、100 mg/L 的濃度，制作標準曲線。每個腺苷酸以其濃度為橫坐標C，以其面積為縱坐標A進行線性回歸分析，得到腺苷酸回歸方程與相關系數分別為:① ATP:A=28.924C+14.144，γ =0.999 90;②ADP:A=31.504C － 12.608，γ =0.999 92;③ AMP:A=46.539C －5.255，γ =0.999 95。ATP、ADP、AMP標準品色譜圖及腦組織中腺苷酸樣品色譜圖詳見圖1。倍信噪比為3，檢出限為1 μg。

圖1 ATP、ADP、AMP的標準品及組織樣品色譜圖Fig.1 The chromatogram of adenine nucleotides standard and tissue sample

2.2 精密度測定實驗

將腺苷酸標準品混合液40 mg/L一天8 h內不定時進樣5次，進行色譜分析，測得日內精密度;配以相同濃度的 ATP、ADP、AMP，每天進樣測定，共 5 d，測得日間精密度。詳見表1。

2.3 回收率實驗

于已知濃度的腦組織中分別加入濃度為20、40及60 mg/L的腺苷酸標準品混合液，測定后扣除樣品中原有含量，得到ATP、ADP、AMP的平均回收率(n=5)。詳見表2。

表1 ATP、ADP和AMP日內、日間精密度Tab.1 The precision of ATP、ADP and AMP (%)

表2 回收率試驗結果Tab.2 The results of recovery rate

2.4 各組實驗測定結果

測定20只低氧暴露小鼠腦組織中ATP、ADP及AMP的含量，共4組，每組5只。詳見表3。

表3 低氧暴露小鼠腦組織中腺苷酸含量檢測結果Tab.3 Concentration of adenosine phosphates in the mouse brain()

表3 低氧暴露小鼠腦組織中腺苷酸含量檢測結果Tab.3 Concentration of adenosine phosphates in the mouse brain()

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs H0 group;ATP:adenosine triphosphate;ADP:adenosine diphosphate;AMP:adenosine monophosphate.

Index H0 H1 H3 H5 ATP 3.23 ±1.2 2.97 ±0.8 8.365 ±3.1＊＊ 5.235 ±3.2*ADP 15.07 ±3.7 20.1 ±7.1 24.42 ±6.0 17.51 ±7.0 AMP 45.61 ±10.7 52.38 ±11.0 45.27 ±5.8 46.59 ±11.5

其中H3及H5組與H0組ATP比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，P ＜0.05，n=5)。

3 討論

流動相的潔凈程度對HPLC實驗的順利進行至關重要，不潔的流動相會使系統(tǒng)壓力增加、基線噪音增大，產生漂移，甚至終止進樣。本實驗使用國產分析純磷酸鹽緩沖液做流動相中的無機鹽成分，由于相對于進口產品，國產分析純試劑價格很便宜但含雜質比較多，因此在進樣前對所配流動相用0.45 μm濾膜過濾，再用0.22 μm的濾膜抽濾的雙重過濾方法，使整個實驗過程中系統(tǒng)壓力一直很平穩(wěn)，確保了實驗順利進行。有文獻［1，4，7］報道流動相中使用了乙腈。乙腈是一種價格昂貴且毒性較大的試劑。本實驗采用甲醇替代乙腈，既經濟又能很好地分離3種腺苷酸。文獻［5］報道使用無有機溶劑的流動相，雖然可以降低實驗費用，但本實驗室的Supelco Discovery C18反相柱不是純水相柱，純水相的流動相會降低柱性能，使柱子中固定相硅膠受損，對反相柱壽命影響很大。本實驗比較過含5%和含10%甲醇的流動相進行分離分析，結果提示含5%的流動相可使3種物質在10 min內就能很好地分離，可操作性強。

生物體產生的ATP是其各種生命活動所需能量的直接來源，有氧情況下產生的ATP是其能量的主要來源。ATP去磷酸化轉化為ADP和AMP，從而釋放能量供生物體利用。低氧預適應是一種細胞內源性保護機制，這種機制在短暫、亞致死性的重復性低氧刺激下可增強組織對繼發(fā)嚴重低氧的耐受程度［8］。動物整體低氧耐受時間是衡量腦組織低氧耐受的一個重要指標，急性重復低氧模型的典型表現是低氧耐受時間隨低氧次數增加呈線性遞增［9］。在有氧受到限制的條件下，腦組織中ATP的含量一過性降低，隨低氧暴露次數增加，ATP含量升高，重復低氧暴露可使腦組織中ATP水平有所升高［10］，本實驗方法測得的大鼠腦組織中ATP與以往文獻［10］報道結果一致，表明本方法測定的數據可信。

目前磷酸腺苷的測定方法還有薄層掃描法［11］及酶學［12］等方法，但整個實驗操作過程很繁瑣。高效液相色譜-可變波長檢測法應是一種經濟、簡便、重現性好，結果準確可信的測定磷酸腺苷的方法，可適用于低氧損傷的基礎與臨床相關研究。

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